人臍帶間充質干細胞對新生鼠腦白質軟化灶的神經保護作用

張寧，擺翔，蔣犁，李偉

(1．東南大學醫學院 江蘇南京 210009;2．江蘇省干細胞工程技術研究中心，江蘇泰州 225300)

隨著產科和新生兒重癥監護診療技術的發展，更多早產的極低出生體重兒和超低出生體重兒獲得了存活。我國城市早產兒發生率為7.8%［1］，每年以1%的比例遞增，但隨之而來的早產兒腦損傷也較為突出。早產兒在圍生期發生的腦損傷主要包括胚胎生發層基質-腦室內出血、出血后腦室積水與腦室周圍白質軟化(periventricular leucumalacia leukomalacia，PVL)，其中PVL被認為是早產兒腦損傷的主要形式，常導致腦癱等后遺癥。腦白質神經膠質細胞中數量最多的是少突膠質細胞，早產兒胎齡越小，其腦白質中少突膠質細胞的前體細胞含量越多。未成熟的晚期少突膠質(oligodendrocyte，OL)前體細胞對缺氧缺血敏感，是PVL病變的主要靶細胞，其缺氧缺血損傷后可凋亡［2］。近年來，國內外許多實驗室應用間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治療神經系統缺血缺氧損傷性疾病［3-4］，許多國家和地區已相繼建立干細胞庫，MSCs已用于臨床一期和二期［5-6］。從各方面成果上看，間充質干細胞用于成人和足月兒神經系統疾病均取得一定療效，應用于未成熟腦組織亦能取得療效。

本研究建立新生大鼠PVL模型，將體外培養擴增的人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUcMSCs)通過腹腔注射移植到模型動物體內，觀察HUcMSCs經腹腔移植后在宿主腦PVL病變部位的遷移以及對腦室周圍軟化灶少突膠質細胞的保護作用，以及初步探討HUcMSCs保護受損腦組織和促進神經重建的可能機制。

1 材料與方法

1． 1 主要試劑及器材

DMEM培養基(Gibco公司，美國)、胎牛血清(杭州四季青公司)、BRDU(Sigma公司，美國)、小鼠抗人BrdU抗體(Sigma公司，美國)。兔抗鼠MBP抗體(Abcam公司，美國)。7.0 T微型磁共振(MicroMRI，美國)。

1． 2 實驗動物模型的制備及其分組

40只清潔級大鼠隨機分為移植組和無菌PBS注射組(對照組)，各組根據處死時間分為24 h(P6d)、14 d(P19d)兩個亞組。大鼠由南京醫科大學實驗動物中心提供，參照文獻［7］法制作模型:分離并結扎左側頸總動脈，清醒后放入自制缺氧箱中，通入含94%氮氣和6%氧氣的氣體(1.5 L·h－1)4 h，造模完成后第5天，P5d即給予移植組 BrdU標記HUcMSCs，每只 1 ×107(0.05 ml)－1，對照組僅給予0.05 ml無菌PBS液，兩組均由腹腔注射。

1． 3 HUcMSCs的來源、培養以及標記

HUcMSCs由江蘇省干細胞工程技術研究中心提供，置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，用0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液消化、傳代后取第2代用于移植。進行細胞移植前用含BrdU(3 mg·L－1)的培養基培養48 h后用于移植。

1． 4 免疫組織化學染色以及組織病理觀察

于P6d、19d斷頭取腦，4%多聚甲醛固定24 h，取視交叉水平腦組織分別作石蠟切片(4 μm)行BrdU、MBP免疫組織化學染色。

1． 5 微型MRI(MicroMRI)掃描和神經行為學測試

移植HUcMSCs組和對照組在P19d分別行MicroMRI掃描和神經行為學測試。

1．5.1 7.0 T微型MRI掃描 移植組大鼠于P19d行T1W1、T2W2微型磁共振掃描。

1．5.2 懸吊實驗 方法:使P19d大鼠前腿抓住一水平玻璃棒(直徑0.5 cm)，離開桌面45 cm，記錄大鼠掉下的時間并進行評分，兩組比較。評分標準:1分，＜10 s;2分，10～30 s;3分，31～119 s;4分，2～5 min;5分，＞5 min。

1．5.3 曠場實驗 裝置為36 cm×36 cm×36 cm無頂方盒，箱底用墨線等分成9個小方格，將大鼠置于中央小方格內，觀察30 s內活動情況。計分標準:大鼠1/2以上身體從所在方格進入相臨方格計1分，大鼠后肢站立計1分，兩者相加為其總分。

1．5.4 拒俘反應實驗 用動物從來沒有接觸過的手套輕撓大鼠，觀察其反應。計分標準:0分:很容易抓取動物;1分，尖叫或回避;2分，尖叫并回避;3分，逃脫;4分，逃脫并尖叫;5分，咬或試圖撕咬手套;6分，主動躍起攻擊。

1． 6 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件。數據以ˉx±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2． 1 人臍帶間充質干細胞形態

倒置顯微鏡下放大100倍觀察經傳代后第2代人臍帶間充質干細胞，呈梭形、螺旋編織狀(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡顯示傳代后第2代HUcMSCs呈梭形、螺旋編織狀(×100)Fig 1 The morphology of the human mesenchymal stem cells(×100)

2． 2 病理學變化

2．2.1 人臍帶間充質干細胞移植后在宿主腦內遷移及分布 經腹腔移植人臍帶間充質干細胞24 h后，移植組可見BrdU(+)陽性示蹤人臍帶間充質干細胞(圖2A);對照組(PBS溶液注射組)未見BrdU(+)示蹤人臍帶間充質干細胞(圖2B)。

2．2.2 移植人臍帶間充質干細胞腦內病理變化 移植人臍帶間充質干細胞后第14天(P19d)，HUcMSCs移植組腦室旁白質致密，空泡體積小且數量少(圖3A);PBS溶液注射組腦室旁白質疏松，空泡體積大且數量較多(圖3B)。

2．2.3 移植HUcMSCs促進腦損傷區域膠質細胞的存活 移植人臍帶間充質干細胞后第14天(P19d)，移植HUcMSCs組髓磷脂堿性蛋白(MBP)染色陽性細胞數(圖4A)明顯多于載體溶液對照組(圖4B)。每個視野HUeMSCs組MBP標記陽性數為(13．95±1．57)個，大于PBS組的(10．22±1．02)個，差異有統計學意義(P ＜0．05)。

2． 3 MicroMRI掃描

移植組于造模后第1天(P6d)MicroMRI掃描在T2W2上可見明顯高信號(圖5A)，移植后第14天(P19d)在T2W2上未見異常信號(圖5B)。對照組于造模后第1天(P6d)MicroMRI掃描，在T2W2上可見明顯高信號(圖5C)，第14天(P19d)在T1W1可見低信號，腦白質軟化灶形成(圖5D)。

2． 4 行為學測定

大鼠生后第19天時(P19d)模型組大鼠懸吊試驗、曠場試驗、拒俘反應實驗評分均較對照組低(P＜0.05)，見表1。

圖2 BrdU免疫組化染色(×200)A．Transplantation group BrdU(+)cells(black arrow);B．The control group showed no BrdU(+)cellsFig 2 BrdU immunohistochemical staining(×200)

圖3 BrdU免疫組化染色(×400)A．HUcMSCs transplantation group of periventricular white matter is more compact，the volume and the number of bubbles is less;B．PBS solution injection group’s periventricular white matter is loose，the number of the bubble is more，the volume is lagrerFig 3 BrdU immunohistochemical staining(×400)

圖4 MBP免疫組化染色(×200)A．The number of the MBP positive staining cells is more;B．The number of the MBP positive staining cells is lessFig 4 MBP immunohistochemical staining(×200)

3 討 論

本實驗擬以早產兒常見病PVL早期應用HUcMSCs干預后腦局部有良好的神經細胞修復和功能改善為切入點，觀察到給新生PVL大鼠經腹腔移植BrdU標記HUcMSCs后，在腦部的定向遷移以及對新生未成熟鼠缺血缺氧性腦部病灶的神經保護作用。

圖5 MicroMRI掃描HUcMSCs group:A．T2W2 scanning shouw hign signal at p6d;B．T2W2 scanning shouw no abnomal singnal at p19d;C．T2W2 scanning shows high signal at P6d;D．The T1W1 scanning shows low signal(Focal periventricular leukomalacia)Fig 5 MicroMRI scanning

表1 P19D兩組大鼠行為學評分比較(n=10，ˉx±s)分Tab 1 Copmparative study on behaviors of rats(n=10) point

表1 P19D兩組大鼠行為學評分比較(n=10，ˉx±s)分Tab 1 Copmparative study on behaviors of rats(n=10) point

組3．40 ±0．966 3．00 ±0．816 1．60 ±0．516 HUeMSCs 1．80 ±0．789 1．30 ±1．059 0．60 ±0．516 t值別 懸吊試驗 拒俘反應 曠場試驗模型組4．057 4．019 4．330 P值 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

MSCs來源廣泛，可取自骨髓、臍帶、脂肪等組織。HUcMSCs來源于胚胎組織廢棄物-臍帶，取材無創傷性，避免倫理學問題，易于體外提取、保存，且保存時間長，可大量擴增。HUcMsCs具有多向分化潛能，可跨胚層向神經系統分化，且其分化能力強于人成熟組織及器官來源的MSCs;具有免疫調節作用，可異體移植［8］。移植后可向病灶處遷移。此外，臍帶組織來源干細胞在血管和神經發生方面更具有優勢［9］。許多學者應用MSCs治療神經系統病變，研究發現自體或異體MSCs，通過靜脈輸注等途徑能歸巢至腦內損傷部位［10］;這與缺血缺氧性損傷后，血腦屏障通透性增高［11］，細胞易于通過受損血腦屏障，炎癥介質誘導腦內皮細胞表達多種黏附分子，促使HUcMSCs與血管內皮細胞、基膜發生特異性結合有關;同時炎癥因子誘導MSCs定向遷移到腦部受損傷區域［10］。我們的實驗選擇在新生未成熟大鼠缺血缺氧后24 h，此時病變部位炎癥介質產生較多。經腹腔移植 BrdU標記HUcMSCs，觀察到HUcMSCs向宿主腦內受損區域遷移，且主要集中于受損區域，表明經腹腔移植的HUcMSCs能夠通過血腦屏障進入宿主腦內，遷移至損傷區域。應用MSCs治療足月兒缺血缺氧性腦病(hypoxia-ischemic brain damage，HIBD)可刺激神經元和膠質細胞再生，改善足月兒腦功能、減少損傷面積［3］。我們實驗觀察到，接受HUcMSCs移植的新生大鼠未成熟腦組織缺血缺氧后經MBP染色顯示，損傷區存活神經膠質細胞數顯著多于對照組;P19d時HUcMSCs移植組懸吊試驗、拒俘反應、曠場試驗得分均較移植PBS組高，差異有統計學意義(P＜0.05)，移植人間充質干細胞后動物遠期神經行為學改善程度顯著;經微型磁共振掃描亦觀察到接受移植HUcMSCs組腦部損傷面積較注射載體溶液組明顯減少，表明HUcMSCs移植可縮小新生大鼠PVL腦損傷區腦白質損傷面積，這與 Koh等［12］的研究結果一致。目前，對于移植HUcMSCs保護缺血缺氧性腦損傷機理還不清楚。有研究顯示，HUcMSCs與宿主神經細胞相互作用導致HUcMSCs自分泌營養因子或周圍腦組織旁分泌營養因子的增加［12］，促進腦細胞的存活。此外，募集祖細胞到受損區域，提高損傷區域細胞增殖，同時促進這些增殖細胞分化為神經元和膠質細胞［13-14］，抑制凋亡，重建神經組織功能。我們推測早產兒腦組織處于未成熟狀態，其再生和修復潛能大，給予HUcMSCs治療后，可刺激體內再生，有效修復受損腦組織。

HUcMSCs是一種治療早產兒缺血缺氧性腦損傷極有潛力的細胞，為新生未成熟神經系統疾病的治療開辟了廣闊前景，但HUcMSCs治療新生鼠PVL確切機制還有待進一步深入研究。［參考文獻］

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