人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對新生鼠腦白質(zhì)軟化灶的神經(jīng)保護(hù)作用

張寧，擺翔，蔣犁，李偉

(1．東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 江蘇南京 210009;2．江蘇省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，江蘇泰州 225300)

隨著產(chǎn)科和新生兒重癥監(jiān)護(hù)診療技術(shù)的發(fā)展，更多早產(chǎn)的極低出生體重兒和超低出生體重兒獲得了存活。我國城市早產(chǎn)兒發(fā)生率為7.8%［1］，每年以1%的比例遞增，但隨之而來的早產(chǎn)兒腦損傷也較為突出。早產(chǎn)兒在圍生期發(fā)生的腦損傷主要包括胚胎生發(fā)層基質(zhì)-腦室內(nèi)出血、出血后腦室積水與腦室周圍白質(zhì)軟化(periventricular leucumalacia leukomalacia，PVL)，其中PVL被認(rèn)為是早產(chǎn)兒腦損傷的主要形式，常導(dǎo)致腦癱等后遺癥。腦白質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中數(shù)量最多的是少突膠質(zhì)細(xì)胞，早產(chǎn)兒胎齡越小，其腦白質(zhì)中少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞含量越多。未成熟的晚期少突膠質(zhì)(oligodendrocyte，OL)前體細(xì)胞對缺氧缺血敏感，是PVL病變的主要靶細(xì)胞，其缺氧缺血損傷后可凋亡［2］。近年來，國內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治療神經(jīng)系統(tǒng)缺血缺氧損傷性疾病［3-4］，許多國家和地區(qū)已相繼建立干細(xì)胞庫，MSCs已用于臨床一期和二期［5-6］。從各方面成果上看，間充質(zhì)干細(xì)胞用于成人和足月兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病均取得一定療效，應(yīng)用于未成熟腦組織亦能取得療效。

本研究建立新生大鼠PVL模型，將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUcMSCs)通過腹腔注射移植到模型動物體內(nèi)，觀察HUcMSCs經(jīng)腹腔移植后在宿主腦PVL病變部位的遷移以及對腦室周圍軟化灶少突膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用，以及初步探討HUcMSCs保護(hù)受損腦組織和促進(jìn)神經(jīng)重建的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1． 1 主要試劑及器材

DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)、胎牛血清(杭州四季青公司)、BRDU(Sigma公司，美國)、小鼠抗人BrdU抗體(Sigma公司，美國)。兔抗鼠MBP抗體(Abcam公司，美國)。7.0 T微型磁共振(MicroMRI，美國)。

1． 2 實(shí)驗(yàn)動物模型的制備及其分組

40只清潔級大鼠隨機(jī)分為移植組和無菌PBS注射組(對照組)，各組根據(jù)處死時間分為24 h(P6d)、14 d(P19d)兩個亞組。大鼠由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，參照文獻(xiàn)［7］法制作模型:分離并結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，清醒后放入自制缺氧箱中，通入含94%氮?dú)夂?%氧氣的氣體(1.5 L·h－1)4 h，造模完成后第5天，P5d即給予移植組 BrdU標(biāo)記HUcMSCs，每只 1 ×107(0.05 ml)－1，對照組僅給予0.05 ml無菌PBS液，兩組均由腹腔注射。

1． 3 HUcMSCs的來源、培養(yǎng)以及標(biāo)記

HUcMSCs由江蘇省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心提供，置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，用0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液消化、傳代后取第2代用于移植。進(jìn)行細(xì)胞移植前用含BrdU(3 mg·L－1)的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后用于移植。

1． 4 免疫組織化學(xué)染色以及組織病理觀察

于P6d、19d斷頭取腦，4%多聚甲醛固定24 h，取視交叉水平腦組織分別作石蠟切片(4 μm)行BrdU、MBP免疫組織化學(xué)染色。

1． 5 微型MRI(MicroMRI)掃描和神經(jīng)行為學(xué)測試

移植HUcMSCs組和對照組在P19d分別行MicroMRI掃描和神經(jīng)行為學(xué)測試。

1．5.1 7.0 T微型MRI掃描 移植組大鼠于P19d行T1W1、T2W2微型磁共振掃描。

1．5.2 懸吊實(shí)驗(yàn) 方法:使P19d大鼠前腿抓住一水平玻璃棒(直徑0.5 cm)，離開桌面45 cm，記錄大鼠掉下的時間并進(jìn)行評分，兩組比較。評分標(biāo)準(zhǔn):1分，＜10 s;2分，10～30 s;3分，31～119 s;4分，2～5 min;5分，＞5 min。

1．5.3 曠場實(shí)驗(yàn) 裝置為36 cm×36 cm×36 cm無頂方盒，箱底用墨線等分成9個小方格，將大鼠置于中央小方格內(nèi)，觀察30 s內(nèi)活動情況。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):大鼠1/2以上身體從所在方格進(jìn)入相臨方格計(jì)1分，大鼠后肢站立計(jì)1分，兩者相加為其總分。

1．5.4 拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 用動物從來沒有接觸過的手套輕撓大鼠，觀察其反應(yīng)。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):0分:很容易抓取動物;1分，尖叫或回避;2分，尖叫并回避;3分，逃脫;4分，逃脫并尖叫;5分，咬或試圖撕咬手套;6分，主動躍起攻擊。

1． 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件。數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2． 1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)

倒置顯微鏡下放大100倍觀察經(jīng)傳代后第2代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，呈梭形、螺旋編織狀(圖1)。

圖1 倒置顯微鏡顯示傳代后第2代HUcMSCs呈梭形、螺旋編織狀(×100)Fig 1 The morphology of the human mesenchymal stem cells(×100)

2． 2 病理學(xué)變化

2．2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植后在宿主腦內(nèi)遷移及分布 經(jīng)腹腔移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞24 h后，移植組可見BrdU(+)陽性示蹤人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(圖2A);對照組(PBS溶液注射組)未見BrdU(+)示蹤人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(圖2B)。

2．2.2 移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞腦內(nèi)病理變化 移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后第14天(P19d)，HUcMSCs移植組腦室旁白質(zhì)致密，空泡體積小且數(shù)量少(圖3A);PBS溶液注射組腦室旁白質(zhì)疏松，空泡體積大且數(shù)量較多(圖3B)。

2．2.3 移植HUcMSCs促進(jìn)腦損傷區(qū)域膠質(zhì)細(xì)胞的存活 移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后第14天(P19d)，移植HUcMSCs組髓磷脂堿性蛋白(MBP)染色陽性細(xì)胞數(shù)(圖4A)明顯多于載體溶液對照組(圖4B)。每個視野HUeMSCs組MBP標(biāo)記陽性數(shù)為(13．95±1．57)個，大于PBS組的(10．22±1．02)個，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)。

2． 3 MicroMRI掃描

移植組于造模后第1天(P6d)MicroMRI掃描在T2W2上可見明顯高信號(圖5A)，移植后第14天(P19d)在T2W2上未見異常信號(圖5B)。對照組于造模后第1天(P6d)MicroMRI掃描，在T2W2上可見明顯高信號(圖5C)，第14天(P19d)在T1W1可見低信號，腦白質(zhì)軟化灶形成(圖5D)。

2． 4 行為學(xué)測定

大鼠生后第19天時(P19d)模型組大鼠懸吊試驗(yàn)、曠場試驗(yàn)、拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)評分均較對照組低(P＜0.05)，見表1。

圖2 BrdU免疫組化染色(×200)A．Transplantation group BrdU(+)cells(black arrow);B．The control group showed no BrdU(+)cellsFig 2 BrdU immunohistochemical staining(×200)

圖3 BrdU免疫組化染色(×400)A．HUcMSCs transplantation group of periventricular white matter is more compact，the volume and the number of bubbles is less;B．PBS solution injection group’s periventricular white matter is loose，the number of the bubble is more，the volume is lagrerFig 3 BrdU immunohistochemical staining(×400)

圖4 MBP免疫組化染色(×200)A．The number of the MBP positive staining cells is more;B．The number of the MBP positive staining cells is lessFig 4 MBP immunohistochemical staining(×200)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)擬以早產(chǎn)兒常見病PVL早期應(yīng)用HUcMSCs干預(yù)后腦局部有良好的神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)和功能改善為切入點(diǎn)，觀察到給新生PVL大鼠經(jīng)腹腔移植BrdU標(biāo)記HUcMSCs后，在腦部的定向遷移以及對新生未成熟鼠缺血缺氧性腦部病灶的神經(jīng)保護(hù)作用。

圖5 MicroMRI掃描HUcMSCs group:A．T2W2 scanning shouw hign signal at p6d;B．T2W2 scanning shouw no abnomal singnal at p19d;C．T2W2 scanning shows high signal at P6d;D．The T1W1 scanning shows low signal(Focal periventricular leukomalacia)Fig 5 MicroMRI scanning

表1 P19D兩組大鼠行為學(xué)評分比較(n=10，ˉx±s)分Tab 1 Copmparative study on behaviors of rats(n=10) point

表1 P19D兩組大鼠行為學(xué)評分比較(n=10，ˉx±s)分Tab 1 Copmparative study on behaviors of rats(n=10) point

組3．40 ±0．966 3．00 ±0．816 1．60 ±0．516 HUeMSCs 1．80 ±0．789 1．30 ±1．059 0．60 ±0．516 t值別 懸吊試驗(yàn) 拒俘反應(yīng) 曠場試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M4．057 4．019 4．330 P值 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

MSCs來源廣泛，可取自骨髓、臍帶、脂肪等組織。HUcMSCs來源于胚胎組織廢棄物-臍帶，取材無創(chuàng)傷性，避免倫理學(xué)問題，易于體外提取、保存，且保存時間長，可大量擴(kuò)增。HUcMsCs具有多向分化潛能，可跨胚層向神經(jīng)系統(tǒng)分化，且其分化能力強(qiáng)于人成熟組織及器官來源的MSCs;具有免疫調(diào)節(jié)作用，可異體移植［8］。移植后可向病灶處遷移。此外，臍帶組織來源干細(xì)胞在血管和神經(jīng)發(fā)生方面更具有優(yōu)勢［9］。許多學(xué)者應(yīng)用MSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)病變，研究發(fā)現(xiàn)自體或異體MSCs，通過靜脈輸注等途徑能歸巢至腦內(nèi)損傷部位［10］;這與缺血缺氧性損傷后，血腦屏障通透性增高［11］，細(xì)胞易于通過受損血腦屏障，炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)腦內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種黏附分子，促使HUcMSCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜發(fā)生特異性結(jié)合有關(guān);同時炎癥因子誘導(dǎo)MSCs定向遷移到腦部受損傷區(qū)域［10］。我們的實(shí)驗(yàn)選擇在新生未成熟大鼠缺血缺氧后24 h，此時病變部位炎癥介質(zhì)產(chǎn)生較多。經(jīng)腹腔移植 BrdU標(biāo)記HUcMSCs，觀察到HUcMSCs向宿主腦內(nèi)受損區(qū)域遷移，且主要集中于受損區(qū)域，表明經(jīng)腹腔移植的HUcMSCs能夠通過血腦屏障進(jìn)入宿主腦內(nèi)，遷移至損傷區(qū)域。應(yīng)用MSCs治療足月兒缺血缺氧性腦病(hypoxia-ischemic brain damage，HIBD)可刺激神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞再生，改善足月兒腦功能、減少損傷面積［3］。我們實(shí)驗(yàn)觀察到，接受HUcMSCs移植的新生大鼠未成熟腦組織缺血缺氧后經(jīng)MBP染色顯示，損傷區(qū)存活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)顯著多于對照組;P19d時HUcMSCs移植組懸吊試驗(yàn)、拒俘反應(yīng)、曠場試驗(yàn)得分均較移植PBS組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，移植人間充質(zhì)干細(xì)胞后動物遠(yuǎn)期神經(jīng)行為學(xué)改善程度顯著;經(jīng)微型磁共振掃描亦觀察到接受移植HUcMSCs組腦部損傷面積較注射載體溶液組明顯減少，表明HUcMSCs移植可縮小新生大鼠PVL腦損傷區(qū)腦白質(zhì)損傷面積，這與 Koh等［12］的研究結(jié)果一致。目前，對于移植HUcMSCs保護(hù)缺血缺氧性腦損傷機(jī)理還不清楚。有研究顯示，HUcMSCs與宿主神經(jīng)細(xì)胞相互作用導(dǎo)致HUcMSCs自分泌營養(yǎng)因子或周圍腦組織旁分泌營養(yǎng)因子的增加［12］，促進(jìn)腦細(xì)胞的存活。此外，募集祖細(xì)胞到受損區(qū)域，提高損傷區(qū)域細(xì)胞增殖，同時促進(jìn)這些增殖細(xì)胞分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞［13-14］，抑制凋亡，重建神經(jīng)組織功能。我們推測早產(chǎn)兒腦組織處于未成熟狀態(tài)，其再生和修復(fù)潛能大，給予HUcMSCs治療后，可刺激體內(nèi)再生，有效修復(fù)受損腦組織。

HUcMSCs是一種治療早產(chǎn)兒缺血缺氧性腦損傷極有潛力的細(xì)胞，為新生未成熟神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療開辟了廣闊前景，但HUcMSCs治療新生鼠PVL確切機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。［參考文獻(xiàn)］

［1］陳惠金．努力提高我國早產(chǎn)兒腦損傷的診斷和防治水平［J］．臨床兒科雜志，2006，24(3):163-165．

［2］李晉輝，母得志．早產(chǎn)兒缺氧缺血性腦白質(zhì)損傷的神經(jīng)病理學(xué)［J］．中國當(dāng)代兒科雜志，2008，10(1):94-97．

［3］PIMENTAL-COELHO P M，MENDEZ-OTERO R．Cell therapy for neonatal hypoxic ischemic encephathy［J］．Stem Cells Dev，2010，19(3):299-310．

［4］胡琳燕，余加林，陳波曼，等．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植改善缺氧缺血性腦損傷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的最佳時間［J］．中國新生兒科雜志，2010，25(5):286-289．

［5］NELSON T J，BEHFAR A，YAMADA S，et al．Stem cell platforms for regenerative medicine［J］．Clin Transl Sci，2009，2(3):222-227．

［6］THIRUMALA S，GOEBEL W S，WOODS E J．Clinical grade adult stem cell banking［J］．Organogenesis，2009，5(3):143-154．

［7］BACK S A，HAN B H，LUO N L，et al．Selective vulnerability of late oligodendendrocyte progenitors to hypoxia ischemia［J］．J Neurosci，2002，22(2):455-463．

［8］ANZALONE R，lo IACONO M，CORRAO S，et al．New emerging potentials for human Wharton's Jelly mesenchymal stem cells:Immunological features and hepatocyte-like differentiative capacity［J］．Stem Cells Dev，2010，19(4):423-438．

［9］SECCO M，MOREIRA Y B，ZUCCONI E，et al．Gene expression profile of mesenchymal stem cells from paired umbilical cord units:cord is different from blood stem cell［J］．Stem Cell Rev，2009，5(4):387-401．

［10］YU G，BORLONGAN C V，STAHL C E，et al．Systemic delivery of umbilical cord blood cells for stroke therapy:a review［J］．Restor Neurol Neurosci，2009，27(1):41-54．

［11］吳麗文，尹飛，彭鏡，等．緊密連接蛋白 ZO-1、occludin和actin參與缺氧缺血誘導(dǎo)的血腦屏障通透性增加［J］．中國當(dāng)代兒科雜志，2008，10(4):513-516．

［12］KOH S H，KIM K S，CHOI M R，et al．Implantation of human umbilical cord-derived mesenchymal stemcells as a neuroprotective therapy for ischemic stroke in rats［J］．Brain Res，2008，1229:233-248．

［13］HALL A A，GUYER A G，LEON ARDO C C，et al．Umbilical cord blood cells directly suppress ischemic oligodendrocyte cell death［J］．J Neuro sci Res，2009，87(2):333-341．

［14］van VELTHOVEN C T，KAVELAARS A，van BEL F，et al．Regeneration of the ischemic brain by engineered stem cells:fuelling endogenous repair processes［J］．Brain Res Rev，2009，61(1):1-13．