骨髓增生異常綜合征患者中TET2基因突變的檢測與臨床意義

吳芬，陳蘇寧，蔣慧，王謙，潘金蘭，吳亞芳，丁家華，陳寶安，余正平，程堅，王俊，趙剛

(1．東南大學醫學院，江蘇 南京 210009;2．東南大學附屬中大醫院 血液科，江蘇南京 210009;3．江蘇省血液病研究所，江蘇 蘇州 215006)

骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組造血干細胞惡性克隆性疾病，其特征為髓系細胞(粒系、紅系、巨核系)一系或多系發育異常和無效造血，外周血細胞一系或多系減少及急性髓細胞白血病(acute myelogenous leukemia，AML)轉化的高風險性［1］。DNA甲基化在MDS發病中起重要作用。近年來，去甲基藥物地西他濱已被證實對MDS患者有肯定療效，已成為一線治療藥物［1-4］。2008 年，Delhommeau 等［5］首次在髓系腫瘤中發現一種新的TET2基因。該基因是TET家族的一個成員，位于4q24，大小約150 kb，有11個外顯子，可能是一種抑癌基因，參與5-甲基胞嘧啶與5-羥甲基胞嘧啶之間的轉化，調節甲基化［6］。有報道稱其與惡性血液系統疾病有關［7-8］。目前多項研究［5，9］顯示，在髓系腫瘤中發現有 TET2 基因突變，以MDS多見，且突變發生于96%的骨髓原始細胞，提示其與該病的發生密切相關。MDS患者預后不良，約30%的轉化為AML，但多數死于骨髓衰竭引起的并發癥［10］。本研究通過檢測MDS患者中TET2基因突變的發生率來初步探討該基因突變對患者預后的影響。

1 對象與方法

1． 1 研究對象

隨機選取2002年至2010年于東南大學醫學院附屬中大醫院血液科與蘇州大學附屬第一醫院血液科95例初診MDS患者。男56例，女39例，男女之比為1.44∶1;中位年齡為55歲(15～79歲)。根據2008年WHO分類和分型標準進行診斷與分型［11］，參照MDS標準方案進行治療與療效評價［12］。

1． 2 方法

1．2．1 抽提基因組DNA及PCR 取患者骨髓單個核細胞5×106個或染色體懸液，PBS洗滌1次。選用Invitrogen公司(美國)提供的PureLinkTMGenomic DNA Kits試劑盒抽提基因組DNA，使用DNA測定儀檢測產物的濃度和純度后儲存于－20℃冰箱備用。PCR總體系為 25 μl:MIX(TIAN GEN)12．5 μl，基因組 DNA模板 1 μl，上游、下游引物各 1 μl，ddH2O 9.5 μl，反應條件及引物序列見表1。PCR產物經1．2%的瓊脂糖凝膠電泳(電壓110 V，電流400 mA，時間40 min)，紫外光透視儀分析圖像并照相。PCR產物于4℃冰箱保存，1周內測序。

表1 TET2基因引物序列

1．2．2 染色體核型分析 骨髓細胞經過24 h短期培養后，按常規制備染色體懸液，熱變性R顯帶，平均每例分析20個中期分裂相，根據《人類細胞遺傳學國際命名制(ISCN2005)》進行核型描述。

1．2．3 基因突變檢測 PCR擴增產物送至上海裕晶生物科技公司完成測序，結果與NCBI人類TET2基因序列進行比對，檢出突變。

1． 3 統計學處理

采用統計學軟件SPSS 17．0。定量資料采用秩合檢驗或精確t檢驗，數據以ˉx±s或中位數表示;定性資料采用χ2檢驗，生存情況描述運用Kaplan-Meier曲線，雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2． 1 臨床特征

據2008年WHO分類和分型標準對95例初診MDS患者進行診斷和分型，MDS-RCUD 18例，占18.9%，RA 7例，RT 1例，RN 1例;MDS-RARS 3例，占3.1%;MDS-RCMD 21例，占22.1%;MDS-RAEB1 15例，占15.8%;MDS-RAEB2 19例，占20.0%;MDSU 19例，占20.0%。中位白細胞數值為2.9×109L－1［(0.8～34.4)×109L－1］，中位中性粒細胞數值為1.22×109L－1［(0 ～10.54)×109L－1］;中位血小板數值為72×109L－1［(10 ～615)×109L－1］;中位血紅蛋白值為 74 g·L－1(30 ～142 g·L－1);外周血 3 系正常2例，單系減少19例，2系減少40例，3系減少34例;IPSS危險分級為:低危組6例，中危1組65例，中危2組18例，高危組6例。

2． 2 TET2 突變檢測

95例初診MDS患者中有11例發生TET2基因突變，突變率為11.6%(95%CI為5.2% ～18.0%)，包括點突變、插入突變和缺失突變，其中6例發生錯義突變，1例出現2次錯義突變，2例同義突變，2例無義突變;5例突變出現于3號外顯子，2例于6號外顯子，1例于7號外顯子，3例于11號外顯子。TET2基因突變集中于3號外顯子并且以錯義突變多見。該11例TET2基因突變患者的臨床特征及突變相關信息見表2與圖1。

2． 3 TET2基因突變臨床意義

對95例初診MDS患者進行隨訪，隨訪截止日期至2011年06月30日，隨訪有效率為63.2%。60例患者中位隨訪時間為13個月(2～73個月)，隨訪中死亡的患者均死于MDS。發生TET2基因突變的初診MDS患者有11例，中位生存期9個月(5～28個月);未發生該基因突變者有51例，中位生存期為15個月(3～73個月)。將隨訪到的60例初診MDS患者分為兩組(突變組與野生組)進行統計學分析，結果顯示兩組患者在性別、年齡、血紅蛋白計數、白細胞計數、中性粒細胞計數及骨髓原始細胞所占比例上均無統計學差異(P＞0.05);再根據IPSS國際預后評分系統，兩組患者在外周血血象減少種類和細胞遺傳學方面亦無統計學差異(P＞0.05)。數據分析顯示，突變組MDS患者6年累積存活率為11.1%(1/9)，野生組患者6年累積存活率為55.74%(34/61)，兩組患者總生存率有明顯的統計學差異(P＜0.05)，伴有TET2基因突變的MDS患者中位生存期較未發生突變者短(9個月vs 15個月，P=0.000)(見圖2)，兩組MDS患者的一般臨床資料見表3。

表2 TET2基因突變的11例MDS患者的臨床特征與突變相關信息

圖1 TET2基因突變類型

表3 TET2基因突變組與野生組MDS患者一般臨床資料

圖2 TET2基因突變與未突變的MDS患者生存曲線

3 討 論

在髓系腫瘤中，MDS是一組源于造血干細胞的惡性克隆性疾病。形態學(外周血和骨髓)、免疫學、細胞遺傳學及IPSS預后積分系統，是MDS診斷分型與預后評價的主要方法和標準。染色體核型分析與熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)作為細胞遺傳學分析的重要手段［10，13］，約50%的 MDS患者可檢測到細胞遺傳學異常［10］。根據IPSS預后評分標準，僅幾種再現性染色體異常，如－5/5q－、－7/7q－、20q－、－Y等與MDS的預后有關。近年來，在髓系腫瘤中發現多種基因突變如 TET2、RUNX1、CBL 等［6，14］，可能與疾病的發生發展有關［5，7，14］，這些微小分子異常采用常規檢測方法較難發現。2009年，Langemeijer等［9］在MDS患者中通過基因芯片和基因測序法檢測出TET2基因突變(26%)，且96%骨髓原始細胞包括CD34+祖細胞在內的各系分化細胞中均有該基因突變，提示其與MDS發病有關。此外，突變也見于骨髓增殖性腫瘤(MPN)、慢性粒單核細胞白血病(CMML)和AML，表明該基因可能是髓系腫瘤高度相關的新型分子［5，15］。

本研究采用基因直接測序法檢測國內初診MDS患者TET2基因的突變率。結果顯示，95例初診MDS患者中TET2基因突變率為11.6%，包括錯義突變、同義突變和無義突變，且突變多集中于3號外顯子。TET2在MDS中是迄今為止發現最常見的突變基因，可能與細胞的惡性克隆有關［16］。該基因突變發生在MDS早期，可出現多次突變，其mRNA在所有粒系細胞中均低表達，表明該基因可抑制細胞增殖［9］。由于所有MDS患者均存在成熟粒細胞形態學的缺陷，TET2基因表達下降可能是由MDS中粒細胞異常分化引起的，這些現象提示該基因與髓系細胞分化有關。TET2基因的功能尚不清楚，但有文章指出其同源TET1基因能夠將5-甲基胞嘧啶轉化為5-羥甲基胞嘧啶，參與甲基化調控，TET2基因也具有相同的酶活性，其突變后可增強DNA甲基化，促進細胞惡性克隆增殖［5，16-17］。

目前，分子水平上TET2基因突變對MDS患者預后影響尚不明確［18］。本研究隨訪了60例初診MDS病例，發現9例TET2基因突變，男性多于女性，至隨訪截止時間僅有1例存活且依賴成分輸血。本組從性別、年齡、血液學(血紅蛋白、白細胞及血小板)、骨髓原始細胞比例、外周血細胞減少種類及核型異常檢出率上進行分析，兩組間均無統計學差異，與國外文獻報道的結論［19］相同。盡管本研究中TET2基因突變組與野生組在性別與年齡上無差異，但亦有文獻［20］報道MDS患者預后與年齡、性別、是否依賴輸血有關，年齡越大，預后越差，男性比女性患者預后差，依賴輸血者的生存期短于不依賴輸血者。此外，通過分析發現，伴有TET2基因突變患者的中位生存期僅有9個月，且生存率僅有11.1%，較未發生該基因突變者顯著減低。本組TET2基因突變的MDS患者中位生存期與生存率均低于國外相關研究報道［5，9］。分析可能原因為:(1)MDS病例少，且隨訪困難;(2)MDS患者多為65～75歲老年人，其中部分需要依賴成分輸血［20-21］;(3)MDS病情復雜，衍變迅速，患者的醫從性差。

綜上所述，骨髓增生異常綜合征是一組克隆性造血干細胞疾病，其發生與進展是一個極其復雜的多階段過程，導致臨床患者有很強的異質性。TET2基因突變是一種新型分子學異常，參與MDS異常甲基化和髓系細胞的異常分化，其突變對疾病預后評價有重要的臨床指導意義，去甲基化藥物對于MDS中TET2基因突變患者的治療意義尚待明確。

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