遺傳校正β－地中海貧血患者特異性iPSCs的功能探討

周 林 鄭陳光 楊 澤

β－地中海貧血是一種十分常見的遺傳性血細胞紊亂性疾病，它以β珠蛋白合成減少為特征，影響轉錄、剪接或翻譯的HBB基因的點突變或微小缺失是其常見的分子缺陷。重型β地中海貧血，又稱Cooley’s貧血，患者多表現為重度貧血及肝脾腫大。如果不進行治療，將會影響患者的生長發育，嚴重者可危及其生命。在中國，β－地中海貧血多發于廣東、廣西和海南一帶，嚴重威脅著該地區數百萬人的生命健康。然而，目前還沒有有效的治療措施。

現研究發現，通過超表達分化型體細胞的幾個轉錄因子可以獲得誘導性多功能干細胞(iPSCs)，而這些細胞具有治愈多種遺傳性及退行性疾病的潛能［1，2］。Hanna J等研究發現，患有人源化鏈狀細胞性貧血的模型鼠，通過移植已進行靶基因遺傳校正的iPSCs，可以產生造血干細胞進而得到治愈［3］。

目前，本課題組已由一個2歲的β－41/42純合子的地中海貧血患者的皮膚組織切片中獲得了纖維母細胞，成功地構建了患者特異性iPS細胞并對其基因變異完成遺傳校正。本研究旨在前期研究結果的基礎上，將遺傳校正的iPSCs移植入SCID小鼠中，探討其在SCID小鼠體內的表達情況。該結果將對未來β－地中海貧血的個體化治療的研究提供重要的理論依據。

1.方法

1.1 SCID小鼠脛骨內移植 將8～10周的體重相同的雌性免疫缺陷SCID小鼠隨機分成4組:α－MEM組、piPSHP組、ciPS－HP組與hES－HP組，對其進行6小時的Co－60照射。同時，收集5×105派生于piPSCs、ciPSC和hESCs的CD34+定向造血祖細胞，經MACS濃縮后，在IMDM培養基中懸浮，然后轉入一個28 G的胰島素注射器內。移植時，將注射器針頭垂直插入小鼠脛骨并輕輕轉動，使其管內的懸浮細胞注入脛骨內，完成對SCID小鼠的脛骨內注射移植。

1.2 移植后iPS細胞的功能檢測 移植6周后，收集外周血、移植和非移植的骨髓細胞或脾細胞，進行一下檢測:①使用特異性人類HLAABC抗體和人類CD71抗體進行流式細胞計數分析，檢測SCID的移植細胞的紅細胞生成能力;②采用western blot技術分析其β－珠蛋白和γ－珠蛋白的表達情況。

2.結果

2.1 紅細胞生成能力檢測 移植6周后，收集SCID小鼠外周血、移植與非移植的骨髓細胞和脾血細胞，使用特異性人類HLAABC抗體和人類CD71抗體分別進行流式細胞計數分析，檢測遺傳校正的iPS細胞在SCID移植鼠中的紅細胞生成能力。結果發現:除注射有α－MEM的正常對照小鼠外，其他三組小鼠的外周血及骨髓細胞中均可以檢測到相同比率的HLA－ABC+細胞，骨髓細胞及脾血細胞中可以檢測到相同比率的早幼紅細胞。這些研究結果顯示移植入SCID小鼠體內的iPS細胞具有生成紅細胞的功能。

2.2 β－珠蛋白與γ－珠蛋白的表達情況 分別收集4組移植鼠的外周血，采用western blot技術分析其β－珠蛋白與γ－珠蛋白的表達情況。結果顯示:ciPSC－HP組小鼠β－珠蛋白的表達水平低于hESC－HP組的，其β－珠蛋白的表達水平僅是 hESC－HP組的一半，而α－MEM組和piPSCHP組小鼠的外周血中均未檢測到人類β－珠蛋白的表達;除α－MEM組外，在其他三組中均可以檢測到γ－珠蛋白的表達。hESC－HP、piPSC－HP與ciPSC－HP組的γ－珠蛋白的表達水平相似。這些研究結果表明:遺傳校正的iPSCs在體內經定向造血干細胞分化后可以同hESCs一樣，可以產生人類β－珠蛋白與γ－珠蛋白(見圖1)。

圖1 β－珠蛋白和γ－珠蛋白在移植后的SCID小鼠外周血中的表達情況

3.討論

在本研究中，我們將將β－地中海貧血患者特異性iPS細胞的基因變異進行遺傳校正后，移植入免疫缺陷SCID小鼠中，檢測移植入SCID小鼠的iPS細胞的功能，結果發現:移植入SCID小鼠體內的iPS細胞具有生成紅細胞能力，可以提高SCID小鼠的紅細胞生成量，還可以產生人類特異性β－珠蛋白與γ－珠蛋白。這一研究結果為iPSC應用于臨床治療重癥β地中海貧血提供了新的理論依據。

校正患者特異性iPS細胞的遺傳變異是實現個體化再生醫學的至關重要的一步。我們的研究結果初步證明，遺傳校正的iPS細胞在移植入免疫缺陷SCID小鼠中后，可以在SCID小鼠體內發揮其生成紅細胞和合成β－珠蛋白與γ－珠蛋白的生物學功能，在一定程度上達到治療β－地中海貧血的效果，具有潛在的臨床應用價值。

然而，在實現iPSCs應用于臨床治療β－地中海貧血之前，還有大量的問題亟需我們解決，還有重重困難需要克服。首先，獲得高質量的iPS細胞是將來進行進一步的基因操作的重要前提。最新的蛋白質、mRNA和micro RNA改造iPS細胞技術，為獲得更為有效的患者特異性iPS細胞提供了較為理想的方法［4～6］。另外，還需要進一步優化校正后的iPS細胞定向分化為特異細胞類型的方法。最近的研究發現，不論是在體內還是體外，細胞可以由一種類型轉換為另一種類型。然而，目前還不知道這些轉換后的細胞是否具有分化功能，因為這些細胞的端粒長度可能不會得到適當的修復［7］。值得注意的是，在iPSCs中，端粒的長度可以得到修復［8，9］。總之，我們的研究為iPSC技術結合基因靶向作用，應用于臨床治愈遺傳性疾病如重癥β地中海貧血的潛在性，提供了強有力的理論依據。

4.結論

我們的研究結果顯示:將遺傳校正的iPSCs移植入SCID小鼠體內后，將會提高定向造血干細胞生成正常紅細胞的能力，并且還可以產生人類β－珠蛋白與γ－珠蛋白。該研究結果為“iPSCs可用于臨床治療β－地中海貧血”這一設想提供了理論依據，為治愈遺傳變異性血液病帶來了希望。

1 Park IH，Zhao R，West JA，et al.Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors［J］.Nature，2008，451:141－146.

2 Yu J，Vodyanik MA，Smuga－Otto K，et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells［J］.Science，2007，318:1917－1920.

3 Hanna J，Wernig M，Markoulaki S，et al.Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin［J］.Science，2007，318:1920－1923.

4 Warren L，Manos PD，Ahfeldt T，et al.Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA［J］.Cell Stem Cell，2010，7:618 －630.

5 Miyoshi N，Ishii H，Nagano H，et al.Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs［J］.Cell Stem Cell，2011，8:633 －638.

6 Kim D，Kim CH，Moon JI，et al.Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins［J］.Cell Stem Cell，2009，4:472 －476.

7 Szabo E，Rampalli S，Risueno RM，et al.Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors［J］.Nature，2010，468:521－526.

8 Agarwal S，Loh YH，McLoughlin EM，et al.Telomere elongation in induced pluripotent stem cells from dyskeratosis congenita patients［J］.Nature，2010，464:292－296.

9 Marion RM，Strati K，Li H，et al.Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells［J］.Cell Stem Cell，2009，4:141 －154.