8q24和臨床相關危險因素與中國北京漢族人群前列腺癌患病風險的關系

張玉榮 王建業 霍正浩 魏 東 楊一歌 楊 澤

隨著人們生活水平的日益提高，前列腺癌(prostate cancer，Pca)的發病率日益增加。Pca作為威脅全世界男性泌尿生殖系統的惡性腫瘤，在美國成年男性中其發病率已經超越肺癌躍居首位［1］，在中國成年男性的泌尿生殖系統發病率中位居第3位［2］。Pca的高發病率使得人們對其日益重視。國內外眾多學者對Pca進行了大量的研究，包括其發病機制、臨床表現、診斷及治療方法等的研究。對于病因方面的研究結果顯示Pca的致病因素尚不十分清楚，可能與種族、遺傳、食物、環境、性激素等有關。近期的研究結果則提示某些基因的突變在Pca的發病、進展及轉移中起著重要的作用。本文借鑒國外對于Pca易感基因位點8q24(rs445114，C;rs620861，T;rs6983267，G;rs1447295，A;rs100001454，T;rs7837688，T)的研究結果，在中國北方人群中進行相應易感基因位點的研究，以探索其與中國北京漢族人群Pca臨床相關危險因素之間的關聯性。

1.材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 研究對象:Pca患者來自衛生部北京醫院泌尿外科的門診和住院患者，共124例，所有病例均經病理組織學確證。對照人群共138例，篩選自衛生部北京醫院體檢中心的常規體檢人群，所有入選的對照均為男性，PSA＜4 ng/mL，并且無Pca家族史。所有研究對象均對該檢測項目知情同意，并且提供了外周血用于檢測。

1.1.2 主要試劑:全基因組DNA提取試劑盒購自 Bio Chain公司;Taq DNA聚合酶和dNTP購自北京鼎國生物技術有限公司;LC-green PLUS飽和熒光染料購自美國Idaho公司。引物由上海生工生物技術開發有限公司合成;基因測序由華大基因測序部完成。

1.1.3 主要儀器:PCR擴增儀為美國 MJ公司的PTC-225型PCR儀;高分辨熔解曲線(HRM)基因突變/基因分型檢測系統為美國Idaho公司Lightscanner TMHR-I96;DNA定量分析儀為德國Eppendorf公司的Biophotometer蛋白/核酸比色儀。凝膠成像系統為美國Bio-Rad公司的Gel DOC-2000成像系統。離心機為美國Beckman公司的Allegra TM 21R型離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取及定量:取EDTA抗凝的受試者外周血0.5ml，用全基因組DNA提取試劑盒抽提DNA，通過蛋白/核酸比色儀對提取的基因組DNA進行濃度和純度的分析。根據測定結果將樣本DNA稀釋至20μg/μl的工作液置于4℃冰箱。

1.2.2 PCR 反應:以染色體 8q24 區(rs445114)為例。從Genebank中查取染色體8q24區附近的基因序列，引物設計通過Oligo 6.0和primer5.0軟件完成。實驗用引物詳情見表1，寡核苷酸內參末端用 C3封閉，以阻止延伸反應。PCR反應體系 10μl，其中包含:DNA 模板 1μl，10X PCR，Buffer 1μl，10 mmol/L dNTP 0.2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.1μl，1X LC-green PLUS 飽和熒光染料1μl，寡核苷酸內參0.2μl(高溫寡核苷酸內參與低溫寡核苷酸內參4個片段各0.05μl)，去離子水補充總體積至10 μl。PCR反應條件為:95℃預變性5分鐘后進入主循環，95℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸 60秒，總共35個循環，完成后72℃延伸7分鐘。之后進行HRM分析之前的變性和復性處理，程序為:95℃ 30秒，25℃2分鐘，94℃30秒，24℃ 4分鐘。

表1 PCR的引物序列、退火溫度及其產物長度

表2 測序引物序列

1.2.3 HRM檢測:將擴增好的PCR產物移入HRM專用96孔板內，在Lightscanner TMHR-I 96儀上進行HRM分析:升溫到45℃時，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲線，98℃結束，用LightScanner Call IT軟件對采集后的曲線進行分析，判定基因型(如圖1、圖2)。

圖1 8q24(rs445114)HRM分型的熔解曲線圖

圖2 8q24(rs445114)研究樣本的抽樣測序圖

1.2.4 測序驗證:根據HRM分析的不同熔解曲線確定不同的基因型。從所得的不同基因型的樣本中分別隨機抽取5例樣本進行測序驗證。需測序樣本的DNA重新進行PCR擴增，測序所用引物為:rs445114，退火溫度為50℃，上游序列為 5′-CAAGCAGTGATCCGTTT-3′，下 游 序 列 為 5′-GCAAGTAAGTGCTAAAATAAAGGTA-3′。

PCR 反應體系 50μl:DNA 模板 5μl，10X PCR Buffer 5μl，10mmol/L dNTP 1μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各 0.5μl，去離子水補充總體積至 50μl。PCR反應條件為:95℃預變性5分鐘后進入主循環，95℃變性30秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒，35個循環之后72℃延伸7分鐘。PCR產物將送至華大基因測序部進行測序驗證。

1.3 統計學方法 采用SHEsis軟件進行兩組間的等位基因及基因型差異分析。應用MDR方法進行基因-基因交互作用分析及SPSS16.0進行基因環境交互作用分析。運用Hardy-Weinberg平衡檢驗研究樣本的群體代表性，對照組與病例組間基因型與等位基因的分布用χ2檢驗;為評估風險等位基因和基因型與Pca的相關性，用比值比(OR)和95%的可信區間 (95%CI);以P＜0.05為差異顯著性標準。

2.結果

2.1 基因型分析 以 8q24(rs445114)為例:8q24(rs445114)位點分為3種基因型:TT、CC、CT。通過HRM分型系統分析，可根據樣本的熔解曲線差異，將所有樣本分為3個組。三組之間的熔解曲線差異非常明顯(圖1)。在每組中隨機挑選5例樣本進行測序驗證，進行基因型的確定以及HRM分型結果準確性的評估。HRM分型的結果與測序的結果完全吻合，準確率為100%，測序圖見圖2。測序結果進行網上BLAST比對，序列完全一致。

2.2 8q24(rs445114，C;rs620861，T;rs6983267，G;rs1447295，A;rs100001454，T;rs7837688，T)基因型與等位基因頻率在Pca患者和正常對照中的分布 以Hardy-Weinberg平衡法檢驗正常對照組的基因型頻率的分布具有群體代表性(P ＞ 0.05)。8q24(rs445114，C;rs620861，T;rs6983267，G;rs1447295，A;rs100001454，T;rs7837688，T)的三種基因型頻率在Pca組和正常對照組間的分布無顯著差異，兩種等位基因頻率在兩組間的分布也無顯著差異(P＞0.05)。(見表3)

表3 基因型與等位基因頻率在Pca患者和正常對照中的分布

表3 續表

2.3 單倍型分析 見表4。

表4 8q24上rs445114，rs620861，rs6983267，rs1447295，rs100001454和rs7837688的單倍型分析

2.4 6個SNPs的基因型在Pca患者不同年齡、Gleason評分、PSA濃度及腫瘤分期等的分布(見表5) 攜帶8q24(rs445114，C)TC基因型以及8q24(rs620861，T)TC基因型的人群 Pca易感性與食用洋蔥負相關(P1=0.007，OR=0.31，95%CI=0.12 ～0.79;P2=0.005，OR=0.30，95%CI=0.11 ～0.77)，攜帶8q24(rs6983267，G)TG基因型的人群Pca易感性與飲酒正相關 (P=0.007，OR=10.75，95%CI=1.35 ～86.14)，其他位點與Pca的發病年齡、Gleason評分、PSA濃度以及腫瘤分期等指標均無顯著相關性(P＞0.05)。

表5 6個SNPs的基因型與Pca患者不同年齡、Gleason評分、PSA濃度及腫瘤分期等的關系

表5 續表

3.討論

目前關于Pca發病機制的研究有幾個方向，包括種族、遺傳、食物、環境、性激素等。本文以易感基因作為主要方面，食物、環境等臨床相關危險因素作為次要方面，對Pca進行多種病因分析。8q24區域是目前報道與Pca相關的較為確切的易感位點，最初在冰島人群中發現8q24上有與Pca易感性相關的位點，而后其易感位點在歐美人群中進行了復制，多數報道其與Pca具有相關性。在日本人群的復制研究報告中顯示有與8q24(rs6983267)關聯的報道，也有與8q24(rs6983267)非關聯的報道。因此我們有必要在中國北方人群中進行8q24多個易感位點的研究，觀察這些易感位點是否在中國北方人群中具有研究意義，為國內Pca的病因學研究提供參考。

本文選取8q24上6個位點(rs445114，C;rs620861，T;rs6983267，G;rs1447295，A;rs100001454，T;rs7837688，T)進行研究，3種基因型和2種等位基因分析結果表明對照人群與患患者群之間差異無顯著性(P＞0.05)。我們分析可能的原因是:遺傳背景不同，生活環境有所差異，以及樣本數目不夠多。具體原因還有待于后來的科學工作者們加以實驗證明。8號染色體的某些特定位點突變與多種疾病的發生密切相關。尤其是染色體8q24區的廣泛基因關聯研究(GWAS)報道顯示其與多種癌癥的發生具有密切聯系，例如Pca、乳腺癌［3］、結腸癌、卵巢癌、膀胱癌、慢性淋巴細胞血液病［4～12］等。到目前為止，以及有報道超過14種SNPs在這一區域與各種不同癌癥的發生具有關聯，甚至有多篇文章還顯示8q24的風險區域擁有某種調控能力。在芯片試驗中，眾多癌癥(乳腺癌、膀胱癌等)的8q24風險區域上會富集增強子［13，14］，而且多個研究組芯片實驗還報道了 Pca［15，16］和結腸癌［16，17］的8q24風險區域可以促使癌癥基因的表達。可以看出8q24是多種癌癥研究的熱點區域，這對在此區域內進行Pca的研究具有一定的指導意義。

一個疾病的發生往往是由多種因素引發的。個體從胎兒期到以后的成長過程中，會有多種物理化學生物的因素影響到身體的發育。遺傳是屬于先天從父母那里繼承來的不可改變的因素，然而很多具有易感基因的個體后天并沒有發病，不具有易感基因的個體卻發病，這就要歸功于后天的環境因素。后天的某些生活習慣，接觸的某些物理、化學物質等可能抑制或者誘導原癌基因的轉變。基因與環境的交互作用分析已經逐漸成為科研工作者關注的熱點。基因與環境的交互作用分析也使得我們更全面的了解疾病的發生，更好的對疾病發生給予解釋。本文選取了部分日常生活中常接觸的物質以及一些臨床常規指標對Pca進行了基因與環境的交互作用分析。分析了6個SNPs的基因型與Pca患者不同文化程度、是否接觸有毒物質、是否飲酒，是否食用洋蔥，BPH有無及腫瘤分期等的關系，結果顯示有多個陽性結果，說明基因加上外部影響因素可以綜合影響Pca的發病，攜帶8q24(rs445114，C)TC基因型以及8q24(rs620861，T)TC基因型的人群Pca易感性與食用洋蔥負相關(P1=0.007，OR=0.31，95%CI=0.12 ～0.79;P2=0.005，OR=0.30，95%CI=0.11 ～ 0.77)，攜帶8q24(rs6983267，G)TG基因型的人群Pca易感性與飲酒正相關(P=0.007，OR=10.75，95%CI=1.35 ～ 86.14)。眾多的研究已經表明基因環境交互作用對于疾病的發生和進展具有重要作用，有的會起到協同作用，有的會起到拮抗作用。對這些影響發病的因素進行記錄并統計分析，得出的結果可以幫助疾病的預防。本文報道的結果對Pca的病因作為參考，Pca的研究還有待繼續研究。

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