THADA，PDLIM5，SLC22A3和染色體17q24區多態性與中國北京人群前列腺癌的關聯性研究

王 鋼 焦海燕 楊 闊 徐 勇 楊一歌 霍正浩 楊 澤 王建業※

2寧夏醫科大學醫學遺傳與細胞生物學教研室 750004

3天津醫科大學第二附屬醫院 300211

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是世界老年男性最常見的腫瘤類型，預計在2011年美國男性癌癥診斷超過24萬新病例［1］。我國PCa患病率過去一直較低，近年來隨著人口老齡化增加、生活水平及醫療診斷技術的提高，PCa患病率緩慢增長。以上海為例，前列腺癌每年新發病例數由1984～1989年的1.833人/10萬人口上升至2005年的9.59人/10萬人口［2］。PCa已位居我國男性泌尿、生殖系統惡性腫瘤發病率的第3位，成為影響我國45歲以上男性生活質量和預期壽命的重要疾病之一［3］。

北京的前列腺癌發病率類似于上海［4］。年齡、種族及地理因素等都是構成前列腺癌的風險因素［5］。然而，這些因素都可能無法完全解釋前列腺癌發病率的不同人群之間的差異。因此，在特定的基因，包括8q24區域的活性基因控制，遺傳變異，可以發揮對前列腺癌易感性的不確定性作用。2012年3月至2012年8月，我們對北京市居民中PCa患者和正常對照者 THADA(rs1465618)、PDLIM5(rs17021918)、SLC22A3(rs7679673)和染色體17q24區(rs1859962)進行關聯分析，并分析PCa患者中基因型和表型(臨床、遺傳、膳食習慣、嗜好等)的關系。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象:PCa患者來自衛生部北京醫院泌尿外科，共112例，年齡(50～85)歲，平均年齡74歲，PSA值為0.1 ～1000.0 ng/ml，平均 37.6 ng/ml，均經組織病理學檢查確診。對照組91例，篩選自本院體檢中心的常規體檢人群，均為男性，無PCa和其他腫瘤家族史，PSA值0～3.6ng/ml，平均1.4ng/ml，并經直腸指診和B超等檢查排除PCa，年齡(60～88)歲，平均年齡72歲，與 PCa組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。研究對象均簽署知情同意書，研究程序經本院倫理委員會批準。

1.1.2 試劑:全基因組DNA提取試劑盒購自博爾誠(北京)科技有限公司;Taq DNA聚合酶和dNTP購自北京鼎國生物技術有限公司;飽和熒光染料購自美國Idaho公司。引物由生工生物(上海)有限公司合成;基因測序由華大基因公司完成。

1.1.3 主要儀器:PCR擴增儀為美國MJ公司的PTC.225型PCR儀;高分辨熔解曲線(high resolution melting，HRM)基因突變/基因分型檢測系統為美國Idaho公司的Lightscanner TMHR-I96;DNA定量分析儀為德國Eppendorf公司的Biophotometer蛋白/核酸比色儀。凝膠成像系統為美國Bio.Rad公司的Gel DOC-2000成像系統。離心機為美國Beckman公司的AllegraTM21R型離心機。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取及定量:按試劑盒具體名稱說明書進行操作。樣本DNA置4℃保存。

1.2.2 PCR 反應:從 Gene bank 中查取 rs1465618，rs17021918，rs7679673和rs1859962附近的基因序列，引物設計通過Oligo6.0和Primer 5.0軟件完成。

rs1465618上游引物5′-TCTGGTAGAGCTTGGTAAGTCC-3′，下游引物 5′-ATATTGTGAAGCCTTGGTG-3′，退火溫度59℃;rs17021918 上游引物 5′-GCTGCTATTTTTCCTT-3′，下游引物 5′-TTACTAAGCAGGTGCTC-3′，退火溫度 50℃;rs7679673 上游引物 5′-GCCAAGATTATAGGAA-3′，下游引物 5′-TCATGGGAAAATTCTAC-3′，退 火 溫 度 50℃;rs1859962 上游引物 5′-AGACTTTTCCAAATCCCTG-3′，下游引物5′-GCCCCATTATTAGAAATCTTG-3′，退火溫度 54℃;低溫內參上游引物5′-TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTATATATATATAAATATAATA-C3，下游引物 5′-TATTATATTTATATATATATAATTAATATTATAAATATTTTATAATTTAA-C3。高溫內參上游引物 5′-GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGGAGGTGGGAAGCGGAGGGGCGGG-C3，下游引物5′-CCCGCCCCTCCGCTTCCGCACCTCCAGCAGCCGCTCAGAGTCTCGGGTCAGTGCCGGCCGCGC-C3。寡核苷酸內參末端用C3封閉，以阻止延伸反應。

PCR 反應體系10μl，包括 DNA 模板1μl，10 ×PCR Buffer 1μl，10mmol/L dNTP 0.2μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.2μl，上下游引物(10pmol/μl)各 0.1μl，1 × 飽和熒光染料 0.8μl，寡核苷酸內參總共0.15μl(包括高溫寡核苷酸內參與低溫寡核苷酸內參4個片段)，去離子水補充總體積至10μl。PCR反應條件:95℃預變性5分鐘后進入主循環，95℃變性30秒，退火30秒，72℃延伸6秒，共35個循環，72℃延伸7分鐘。之后進行HRM分析前的變性和復性處理，95℃ 30秒，25℃2分鐘，94℃ 30秒，24℃ 4分鐘。

1.2.3 HRM檢測:將PCR產物移入HRM專用96孔板內，在Lightscanner TMHR-I 96上進行HRM分析:從40℃開始，以0.3℃/秒的斜率采集熔解曲線。到98℃結束，用LightScanner Call IT軟件對采集后的曲線進行分析，判定基因型。

1.2.4 測序驗證:基因分型采用根據HRM分析的不同陸線確定不同的基因型，從所得的不同基因型的個體中分別隨機抽取5例樣本進行測序驗證。測序樣本重新進行PCR擴增，測序引物為:rs1465618上游引物 5′-CCTAAAGCCAAAACAGCA-3′，下 游 引 物 5′-AGTTCCAAAGAATGAAGACC-3′，退火溫度53℃;rs17021918 上游引物5′-ACCTCCCAAGGTAACCTC-3′，下游引物 5′-TTTCTCCCCATAACCACTA-3′，退火溫度 52℃;rs7679673 上游引物 5′-TGTACCTTGAGGTTTACAGATC-3′，下 游引 物 5′-CCCTAAAAGGAACACACAG-3′，退火溫度 53℃;rs1859962 上游引物 5′-CCTTGGACCAGTTCTTGA-3′，下游引物 5′-GGGAAATTTAGCCCCATTAT-3′，退火溫度55℃。PCR反應體系50μl:DNA 模板 5μl，10 × PCR Buffer 5μl，10mmol/L dNTP 1μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)1μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl，去離子水補充總體積至 50μl。PCR 反應條件:95℃預變性5min后進入主循環，95℃變性30秒，退火45秒，72℃延伸60秒，35個循環，之后72℃延伸7分鐘。PCR產物經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，凝膠成像系統觀察合格后，送華大基因公司測序驗證。

圖1 8q24基因rs1465618，rs17021918，rs7679673和 rs1859962HRM分型圖(HRM曲線)

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0軟件處理數據。運用Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)檢驗研究樣本的群體代表性。用比數比(OR)值及其95%置信區間評價相對風險。計量數據以表示，組間比較采用兩個獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney U秩和檢驗，組間基因型頻率及等位基因頻率比較采用 Fisher′s或 Pearson′s χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。采用SHEsis軟件進行連鎖不平衡分析，以P＜0.05說明存在連鎖不平衡。

2.結果

2.1 HWE定律吻合度檢驗 經HWE檢驗，在對照組中rs1465618，rs17021918，rs7679673 和 rs1859962多態性位點的基因型頻率P＞0.05，表明研究來自同一群體，具有較好的群體代表性。

2.2 分型結果 通過 HRM基因分型系統，SNPs rs1465618，rs17021918，rs7679673 和 rs1859962均有 3種基因型，每種基因型的溶解曲線差異非常明顯(圖1)。在每種基因型攜帶者中選5例進行測序驗證給出至少一個測序圖表，進行基因型的確定以及HRM分型結果準確性的評估。HRM分型的結果與測序的結果完全吻合，準確率為100%。測序結果進行網上BLAST比對，序列完全一致。

2.3 PCa候選基因關聯分析 rs1465618，rs17021918，rs7679673和rs1859962的基因型和等位基因型在PCa組和對照組間的分布均無統計學差異(P＞0.05)。結果見表1。

2.4 PCa相關質量表型和基因型的關聯分析 依照PCa

患者的質量性狀(表型)，包括患者的臨床特征、PSA、年齡、腫瘤分期和煙酒等8類觀察指標，這些指標與這4個SNPs位點的各基因型都無關，關聯分析結果見表2。為檢測PCa關聯基因型的遺傳模型，我們采用了顯性和隱性兩種模型表中只有一種模型數據分析。

表1 THADA、PDLIM5、SLC22A3和染色體17q24區4個SNPs的基因型和等位基因在PCa組和對照組中的分布

表2 PCa患者表型與4個基因型的關聯分析

3.討論

近年來，隨著中國人口老齡化以及生活條件的改善，PCa的發病率呈顯著的上升趨勢，已經成為中國老年男性最常見的惡性腫瘤之一。PCa的遺傳流行病學發現:許多因子包括遺傳和膳食因素被證明與PCa的發生密切相關，PCa位居第4位，僅次于唇黑色素瘤，皮膚黑色素瘤和卵巢癌［6］。由此可見，遺傳因素在PCa的發生中起著重要的作用。

PCa的具體病因仍然不清，主要危險因素有老年、家族史和遺傳等。年齡因素是不可變因素，腫瘤發生與衰老和機體退行性變有關，如，PCa在＜45歲人群中罕見，但隨年齡增長，PCa發病率逐漸增加，PCa患者的平均診斷年齡為70歲［7］。尸檢研究揭示，50歲男性中PCa患者占30%，70歲男性約80%患PCa［8］。另一不可變因素是遺傳因素。

THADA基因位于染色體2p21上，最早被發現是甲狀腺腺瘤靶基因，與甲狀腺腺良性腫瘤相關［9］;PDLIM5(PDZ and LIM domain 5)，這是由于該基因其他剪接體的編碼蛋白N端含有PDZ功能域，C端含有三個LIM功能域，定位在4號染色體4q22-23上［10］;SLC22A3位于人類6號染色體上，編碼運送陽離子有機化合物的載體蛋白，作用于強心劑中兒茶酚胺［11］，并且對陽離子藥物例如二甲雙胍作用于心肌層有重要意義;染色體17q24區域Sox9(SRY-related high mobility group-box gene9)基因是一種重要的早期胚胎發育相關基因，是與位于男性Y染色體上的SRY基因(Sex determine region of Y chromosome)同源的家族基因。而SRY基因不是直接調節睪丸的發育而是通過Sox9共同作用才發生作用［12］。本研究聯合分析 THADA(rs1465618)、PDLIM5(rs17021918)、SLC22A3(rs7679673)和染色體17q24區(rs1859962)4個重要的PCa相關基因，并觀察了各自貢獻PCa發生風險的獨立作用。雖然每一基因均有多個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)，但在遺傳病因學研究中，通常在證據(文獻報道和預實驗等)基礎上選擇候選基因，作為疾病關聯研究的策略之一，本組也采用了同樣的研究策略。但本研究表明THADA(rs1465618)、 PDLIM5(rs17021918)、 SLC22A3(rs7679673)和染色體17q24區(rs1859962)與中國北京PCa患病風險無相關性(P＞0.05)，而且基因型與部分表型分析表明與PCa患者的年齡、Gleason評分、PSA濃度及煙酒等均無相關性(P ＞0.05)。

由于本研究存在樣本量較小這一局限性，對于THADA(rs1465618)、PDLIM5(rs17021918)、SLC22A3(rs7679673)和染色體17q24區(rs1859962)和與中國北京人PCa發生相關性的最終定論，還需在其他群體的更大樣本中進行進一步驗證，以便為PCa的病因學研究奠定理論基礎。

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