苦馬豆素人工抗原對家兔的免疫原性研究

王 帥，陳根元，胡建軍，張 玲，馬春暉

（新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室 塔里木大學動物科學學院，阿拉爾 843300）

苦馬豆素（swainsonine，SW） 是豆科棘豆屬（Oxytropis）和黃芪屬（Astragalas）等瘋草植物的主要有毒成分［1］。瘋草在我國分布廣泛，不利于畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前對瘋草蔓延采取的防除方法主要有人工挖除、化學藥劑滅除等，但效果均不理想［2］。而且瘋草為豆科植物，營養(yǎng)成分較為全面［3］。家畜采食瘋草的初期增膘，可充分說明這一點。

目前利用免疫預防的方法使家畜安全利用瘋草，已經(jīng)成為國內(nèi)的研究熱點［4］。SW分子量小（173），屬于半抗原，沒有免疫原性，需要將SW與大分子載體蛋白（如BSA）偶聯(lián)合成人工抗原（如SW-BSA），將合成的人工抗原用于動物免疫，即可誘導動物機體產(chǎn)生抗SW的特異性抗體，使動物獲得對瘋草的免疫力。試驗用人工抗原SW-BSA免疫接種家兔，為制備SW高效價抗體、防治家畜瘋草中毒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑 SW-BSA由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室自行制備；弗氏完全佐劑（FAC），弗氏不完全佐劑（FAI），HRP-羊抗兔 IgG ，Sigma；3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），Amresco；其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 試驗兔 土種家兔18只，雌雄各半，體重2.0 kg±0.1 kg，購自塔里木大學動物科學學院實驗站。

1.1.3 儀器 PowerWave XS型全波長酶標儀，美國；MR231型高速冷凍離心機，法國Jouan；Direct-Q3型超純水系統(tǒng)，美國Millipore；BCD-223GB型冰箱，廣東科龍電器；FA/4A型電子天平，上海精密電子儀器有限公司。

1.2 試驗家兔的處理

試驗家兔進入兔舍前，先用84消毒液對兔舍消毒，然后藥浴殺滅家兔體表寄生蟲；觀察7 d后飼喂左旋咪唑驅(qū)蟲；第14天各兔皮下注射兔瘟疫苗（2 mL/只）。觀察10 d后開始正式試驗。將試驗兔隨機分組后打耳缺，18只兔平均分為對照組（A組）、免疫Ⅰ組（B組）、免疫Ⅱ組（C組），每組6只。

1.3 免疫試驗

參考童德文等［5］的研究進行免疫試驗，對各免疫組使用FAC進行基礎(chǔ)免疫，再以相同免疫途徑進行首免和加強免疫。各免疫組免疫劑量和次數(shù)見表1。攻毒對照組和正常對照組每次注射等體積的抗原乳化液。在每次免疫前1 d對所有試驗家兔空腹采血2份，1份以肝素鋰抗凝得抗凝血，1份制備血清。第3次加強免疫后每隔7 d采血1次，共采血10次。

表1 各免疫組的免疫時間和免疫劑量

1.4 試驗兔血清抗體效價的測定

應用間接血凝試驗（IHA）和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試驗兔血清抗體效價的變化。IHA條件參考童德文等［5］的研究，紅細胞用30μg/L的SW致敏。ELISA條件參考 Watanabe等［6］的研究，測量樣品 OD450值（P）與陰性對照孔OD450值（N），以P/N>2.1判定樣品為陽性。

1.5 E-玫瑰花環(huán)試驗

參考楊合生等［7］的研究，計數(shù)200個淋巴細胞，凡1個淋巴細胞結(jié)合3個紅細胞或以上者為1個玫瑰花環(huán)陽性細胞，計算玫瑰花環(huán)形成率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用EXCEL 2007進行處理，數(shù)據(jù)分析用SPSS 11.5中One-Way ANOVA進行單因素方差分析，差異顯著時采用LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 間接IHA結(jié)果

間接IHA試驗結(jié)果見圖1。所有免疫家兔均在第1次加強免疫后產(chǎn)生了抗體，隨著免疫次數(shù)的增加，免疫家兔的血清抗體滴度明顯升高。第3次加強免疫后14 d達到最高值。2個免疫組家兔血清抗體變化趨勢較為一致，但C組的抗體滴度值始終高于B組。對照組未檢測到抗SW抗體存在。

圖1 IHA檢測家兔血清抗SW抗體效價變化

2.2 間接ELISA結(jié)果

間接ELISA試驗結(jié)果見圖2。所有免疫家兔在第1次加強免疫后產(chǎn)生了抗SW抗體，2個免疫組家兔血清抗體滴度的變化趨勢與IHA檢測基本相同。但第4、6、7、8次采血時B組試驗兔抗體滴度低于IHA檢測；第4、7次采血時C組抗體滴度低于IHA檢測。對照組仍未檢測到抗SW抗體存在。

圖2 ELISA檢測家兔血清抗SW抗體效價變化

2.3 E-玫瑰花環(huán)試驗結(jié)果

免疫試驗期內(nèi)，B組和C組E-玫瑰花環(huán)率呈上升趨勢，并在第6次采血時達到最高值，然后免疫組E-玫瑰花環(huán)率的變化趨勢趨于平緩。從第3次采血開始，C組E-玫瑰花環(huán)率高于B組，到第9次采血時2組E-玫瑰花環(huán)率差異不顯著（P＞0.05）。對照組E-玫瑰花環(huán)率波動較為平緩，但均小于免疫試驗組。具體結(jié)果見圖3。

圖3 試驗兔血清E-玫瑰花環(huán)率變化

3 討論與結(jié)論

我國現(xiàn)有棘豆屬植物120余種，黃芪屬植物280余種，已確定含SW的有10多種［2］。這些含有SW的植物是未來放牧動物的潛在威脅。為了有效預防家畜SW中毒，需要特異、簡便的SW和抗SW抗體分析方法。常用的抗體滴度檢測方法有放射性免疫測定、酶聯(lián)免疫測定、間接血凝試驗和間接血凝抑制試驗測定等。其中酶聯(lián)免疫測定和間接血凝試驗有靈敏性高、特異性強、檢測迅速和成本低廉等特點，目前在抗SW抗體的檢測方面應用較多［7-8］。本試驗檢測抗體滴度的方法采用了間接血凝試驗和間接酶聯(lián)免疫測定，2種方法都可以檢測到抗體，而ELISA法的準確性稍高［5］。SW免疫學檢測方法的確立不僅可用于檢測含SW植物不同生長期SW含量的變化，也可用于檢測不同家畜對SW的耐受劑量，研究SW的作用機理，并對食品安全進行檢查。

人工抗原免疫動物能否產(chǎn)生抗體，不僅與人工抗原的質(zhì)量和免疫動物個體狀況有關(guān)，還與免疫程序有關(guān)。在一定范圍內(nèi)抗原劑量與免疫反應強度呈正相關(guān)，過低與過高都不利于抗體的產(chǎn)生。試驗初期使用小劑量抗原免疫動物，一方面考慮SW抗原決定簇較少，另一方面是因為小劑量可以激活高親和力的淋巴細胞；后期大劑量免疫則是考慮到維持已經(jīng)產(chǎn)生的抗體和進一步激活更多的淋巴細胞。與其他相關(guān)試驗相比［5，7-9］，本試驗抗SW抗體效價的產(chǎn)生時間較為一致，但家兔產(chǎn)生抗體的周期短于山羊，而且抗體效價較高，說明本試驗免疫劑量和時間的設(shè)計是合理的。

E-玫瑰花環(huán)率的變化反應了動物機體免疫力的變化［9］，其中主要受T淋巴細胞的影響。免疫組前期E-玫瑰花環(huán)率上升，可能是因為人工抗原刺激動物機體細胞免疫表達，從而產(chǎn)生了大量高活性的T淋巴細胞，導致E-玫瑰花環(huán)率的增加，說明該免疫反應可以有效阻止進入機體的SW侵害動物的免疫系統(tǒng)。試驗中雖然檢測到家兔機體有抗SW抗體產(chǎn)生，但該抗體能否保護動物在采食瘋草時免于中毒，還有待于試驗的進一步證實。

［1］劉志濱.瘋草中苦馬豆素提取方法研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2006.

［2］高木木.新疆棘豆屬植物研究［D］.新疆石河子：石河子大學，2008.

［3］王帥，胡建軍，阿里木別克，等.南疆地區(qū)小花棘豆的營養(yǎng)成分分析［J］.草業(yè)科學，2010，27（5）：136-139.

［4］童德文.苦馬豆素-BSA的合成及其免疫原性研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2001.

［5］童德文，陳德坤，曹光榮.苦馬豆素-BSA對家兔的免疫原性研究［J］.西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2001，29（5）：11-14.

［6］Watanabe H，Satake A，Kido Y，et al.Monoclonal-based-enzyme-linked immunosorbent assay and immunochromatographic assay for enrofloxacin in biological matrices［J］.Analyst，2002，127：98-103.

［7］楊合生，童德文，趙紅妮，等.苦馬豆素抗血清治療山羊甘肅棘豆中毒的血清學和免疫學指標評價［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2008，17（6）：6-11.

［8］楊合生，童德文，趙紅妮，等.SW-OVA接種家兔血清抗體變化的研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（3）：96-97.

［9］Tong D W，Mu P H，Dong Q，et a1.Immunological evaluation of SWHSA conjugate on goats［J］.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2007，58：61-67.