酶聯免疫檢測試劑盒檢測水產品中孔雀石綠的應用研究

沈 麗張麗君譚 攀葛 虹谷雪平

（1深圳職業技術學院，深圳 518055） （2深圳市三方園生物科技有限公司，深圳 518055）（3深圳市水產品質量監督檢測中心，深圳 518172）

酶聯免疫檢測試劑盒檢測水產品中孔雀石綠的應用研究

沈 麗1*張麗君1譚 攀2葛 虹3谷雪平1

（1深圳職業技術學院，深圳 518055） （2深圳市三方園生物科技有限公司，深圳 518055）（3深圳市水產品質量監督檢測中心，深圳 518172）

利用酶聯免疫試劑盒檢測水產品中孔雀石綠殘留量，研究了國產試劑盒檢測性能，并與高效液相色譜法進行了比較。結果表明：孔雀石綠含量在0.5 μg/kg～8 μg/kg范圍時，試劑盒具有良好線性，最低檢出限為0.16 μg/kg；試劑盒測得孔雀石綠總量的加標回收率在71%～120%，批內變異系數介于5.61%～18.6%；檢測鱖魚實際樣品時，試劑盒和高效液相色譜法定性判定結果一致，定量結果有所差異，試劑盒測得鱖魚樣品中孔雀石綠殘留量為37.75 μg/kg，高效液相色譜法測得結果為46.29 μg/kg，但準確度偏差范圍尚符合國家質量監督檢驗檢疫總局《殘留分析質量控制》的要求。綜上所述，國產酶聯免疫檢測試劑盒操作方便快速，靈敏度較高，重現性較好，適用于大量樣品的快速檢測。

水產品；孔雀石綠；酶聯免疫；鱖魚

孔雀石綠（MG） 是一種三苯甲烷類工業染料，曾因其價廉、高效而被廣泛應用于水產養殖動物的真菌、細菌性疾病的防治，后隨其在魚體的高殘留、對人體的高致癌性作用被逐步發現，孔雀石綠在許多國家被嚴禁使用：歐盟及美國FDA不允許其做為獸藥用于水產業中，我國也將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中。目前檢測孔雀石綠的方法主要有液/質聯用分析法（LC-MS）、高效液相色譜法（HPLC） 和免疫學方法等。LC-MS和HPLC法具有準確、重復性好、適用于定量檢測等優點，是檢測孔雀石綠的最終確認方法，但由于其成本高，操作繁瑣，設備昂貴及操作人員需專業培訓，實驗周期長等原因，難以滿足基層進行現場快速篩查的要求。國外已有高靈敏、商品化的孔雀石綠ELISA檢測試劑盒出售，但總體價格昂貴，導致單次檢測成本居高不下。近幾年，國內也相繼開發了相關的孔雀石綠酶聯免疫快速試劑盒。本研究采用國產孔雀石綠酶聯免疫檢測試劑盒檢測了水產品中殘留孔雀石綠，并與HPLC法進行比較，旨在為適合于現場檢測的酶聯免疫試劑盒在大規模水產品檢測中的實際應用，降低快速檢測孔雀石綠的成本奠定基礎，這對更好地開展水產品質量安全監管具有十分重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

孔雀石綠標準品，Sigma公司；二氯甲烷，色譜純；乙腈，色譜純；乙酸，分析純；無水硫酸鈉，分析純；正己烷，分析純。孔雀石綠酶聯免疫測定試劑盒由深圳市三方圓科技有限公司提供。

微孔板酶標儀（450 nm Thermo Multi skan spectrum）；Agitent1100高效液相色譜，美國Agitent公司；BUCHI R-200旋轉蒸發儀；Evppendor5810R離心機；其他為國產常規儀器。

1.2 方法

以鱖魚為檢測對象，將鱖魚去皮，沿脊背切下肌肉塊，放入高速組織勻漿機20 000 r/min絞碎混勻。將魚樣分別進行酶聯免疫檢測和高效液相色譜測定。

1.2.1 酶聯免疫試劑盒檢測方法

樣品前處理、ELISA測定程序均參照試劑盒中提供的產品說明書進行：2 g樣品加提取液作用，離心得上清液，加氧化劑、正己烷萃取，離心取下層，吹干或蒸干溶劑，乙腈溶解沉淀，取適量溶解液進行酶聯免疫檢測，酶標儀測定OD值。以標準品為對照，每個樣重復3次，所得吸光值的平均值再乘以100，得百分吸光度。

1.2.2 高效液相測定

樣品前處理、色譜柱條件、操作步驟及計算依據國標GB/T20361-2006《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法》。

1.2.3 ELISA工作曲線建立方法

取 0 μg/kg、0.5 μg/kg、1 μg/kg、2 μg/kg、4 μg/kg、8 μg/kg標準品稀釋液分別稀釋 10 倍至終質量分數為 0 μg/kg、0.05 μg/kg、0.1 μg/kg、0.2 μg/kg、0.4 μg/kg、0.8 μg/kg，按照試劑盒說明書中酶聯免疫測定程序，測得各濃度標準品的吸光值，所得吸光值的平均值再乘以100，計算得各濃度標準品的百分吸光度。以標準品質量分數的以10為底的對數值為橫坐標，百分吸光值為縱坐標，繪制工作曲線。

1.2.4 ELISA加標回收率測定方法

稱取2.0 g陰性樣品各6份，加入50 mL聚四氟乙烯離心管中，依次加入不同體積的孔雀石綠標準品，使得魚樣中標準品質量分數分別為0 μg/kg、0.5 μg/kg、1 μg/kg、2 μg/kg、4 μg/kg、8 μg/kg，按照測定各樣品百分吸光度。通過外標法工作曲線計算回收率。

2 結 果

2.1 工作曲線相關性比較

2.1.1 ELISA檢測法工作曲線

下圖1為ELISA檢測法工作曲線。曲線方程為y=-76.002x-10.708，相關系數為 0.9 466。標準曲線中各標準品濃度對應的百分吸光值的標準誤差（RSD） 為1.54%～16.4%。結果表明孔雀石綠在 0.5 μg/kg ～8 μg/kg 范圍具有良好線性，最低檢出限為 0.16 μg/kg。

2.1.2 高效液相-熒光法工作曲線

在高效液相色譜法測定中，配制質量分數在分別為 0.5μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg、20.0 μg/kg、50.0 μg/kg、100.0 μg/kg、200.0 μg/kg的孔雀石綠標準溶液，以峰面積（y） 為縱坐標，以質量分數（x） 為橫坐標，繪制標準曲線，見圖2。曲線方程為y=307.116 02x-1.99e-1，相關系數為 0.999 87。孔雀石綠在 0.5 μg/kg ～ 200 μg/kg范圍具有良好線性，檢出限為0.5 μg/kg。

圖1 ELISA測定孔雀石綠的標準曲線

圖2 高效液相色譜-熒光檢測法測定孔雀石綠的工作曲線

2.2 ELISA檢測回收率、檢出限和重現性

通過樣品加標測定回收率試驗，將樣本的百分吸光值代入工作曲線，從工作曲線上讀出樣本所對應的值，作為10的冪，乘以稀釋倍數，則為樣品中所含孔雀石綠的量。測得孔雀石綠總量的加標回收率在71%～120%，批內變異系數介于5.61%～18.6%，重現性基本能滿足要求，見表1。

表1 孔雀石綠及其代謝物加標回收率測定結果

2.3 鱖魚樣品測定結果

鱖魚樣品經前處理后，同時進行ELISA和高效液相熒光法檢測，檢測結果見表2。檢測結果顯示，高效液相熒光檢測法和ELISA法對鱖魚中陰性樣品的判斷一致，同為未檢出；陽性樣品的檢測結果在數值上有一定的差距，但準確度偏差范圍尚符合國家質量監督檢驗檢疫總局《殘留分析質量控制》的要求，因此可適用于大量樣品的快速初檢。

表2 鱖魚樣品中孔雀石綠測定結果

3 討論

酶聯免疫檢測試劑盒是以免疫學方法為基礎的快速檢測方法，具有快速、靈敏、價格低廉、適合現場大規模檢測等優點，是目前公認的最適合作為藥物殘留檢測的方法之一。目前市面上所售孔雀石綠快速測定試劑盒種類很多，國內外的都有。大致原理基本相似。部分試劑盒分測顯、隱性孔雀綠，但多數測總孔雀石綠。本研究中所用試劑盒采用競爭酶標免疫法，同時把隱性孔雀石綠氧化成孔雀石綠，測得總的孔雀石綠殘留。

通過酶聯免疫試劑盒法和HPLC法檢測樣品中孔雀石綠殘留量比較發現，試劑盒法操作步驟簡單，用時較短，易于高通量檢測，但工作曲線和實際樣品檢測結果表明，試劑盒法的準確度與HPLC相比略低，試劑盒法工作曲線的相關系數為0.9 466，HPLC法相關系數為0.99 987；陽性樣品兩者所測得的結果有一定的差距，可見儀器檢測法的準確度比試劑盒法高，主要原因是目前酶聯免疫檢測過程中以人工加樣、洗板為主，相比儀器而言，操作過程的不穩定性較大，若能采用全自動加樣洗板，應會增加此方法的準確度。本試劑盒的檢測限雖然同國外檢測試劑盒0.082 g/kg還不能相比，但與HPLC的檢測限比較，已經能夠滿足GB/T19857-2005規定孔雀石綠的測定方法檢測限的要求。測得孔雀石綠總量的加標回收率在71%～120%，批內變異系數介于5.61%～18.6%，因此試劑盒法的重現性能夠滿足要求。另外研究中通過10次空白測定，計算3倍標準差，得到最低檢出限為0.16 g/kg，檢測靈敏度為0.05 g/kg，基本能滿足簡單判斷水產品中孔雀石綠殘留陰、陽性樣品的需求。檢測實際樣品時，試劑盒與HPLC法對陰性樣品檢出結果一致。

綜上所述，本次應用的國產試劑盒能夠滿足目前國家標準規定檢測孔雀石綠的基本要求，由于其操作簡單、快速、低成本，適于目前水產品快速檢測迫切需要。但是，同高效色譜-熒光檢測方法一樣，在樣品前處理步驟如均質程度、計算方法上還需要進一步試驗研究，優化條件。加標回收率結果也提示在均質程度、酶標板的處理、樣品的保存、加樣操作等環節都需要更多的探討。與國標測定結果相比，還需要在操作程序等方面進行細致的研究改進，降低標準曲線相關系數的不確定度，以提高檢測的精準度。

［1］ 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.國家標準和管理委員會.GB/T20361-2006水產品種孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法［S］.北京：中國標準出版社，2006.

［2］ 楊金蘭，陳培基，黎智廣,等.高效液相色譜法測定水產品孔雀石綠殘留量的優化研究［J］.南方水產，2010，6（4）：43-48.

［3］ 萬譯文，洪波，曾春芳，等.水產品中孔雀石綠殘留的研究進展［J］.水產科技情報，2010，37（4）：191-197.

［4］ 蔡泓，陳偉，岑小青，等.水產品中孔雀石綠及其代謝物殘留量快速檢測的研究［J］.化學試劑，2006，28（7）：411-413.

［5］ 邢瑋瑋，王榕妹，王俊卿，等.酶聯免疫吸附分析法測定水產品及水中孔雀石綠和無色孔雀石綠［J］.化學研究與應用，2010，22（1）：42-46.

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Application on enzyme-linked immunosorbent assay for determination of malachite green in aquatic products

SHENLi1*ZHANGLi-jun1TANPan2GE Hong3GUXue-ping1
1（Shenzhen polytechnic，Shenzhen 518055，China）2（Shenzhen triphil biotechnologyCo.，Ltd，Shenzhen 518055，China）3（Shenzhen aquatic products qualitysupervision and testingcenter，Shenzhen 518030，China）

Malachite green（MG）residues in aquatic products were determined by using ELISA kit.The performance of domestic reagent kit was studied and compared with high performance liquid chromatography method.The results showed that：this kit has good linearity while the content of the malachite green was in the range of 0.5 μg/kg～ 8 μg/kg，the minimum detectable limit was 0.16 μg/kg.The total recovery rate was 71% ～120%measured by malachite green kit，and the batch coefficient of variation was between 5.61% ～ 18.6%.On detecting of actual samples of mandarin fish，this kit has the same result with high-performance liquid chromatography method,while the quantitative has a varied result.The malachite green residue measured bysample kit was 37.75 μg/kg，while that measured by high performance liquid chromatography was 46.29 μg/kg.The accuracy deviation range was in line with the State Quality Supervision，Inspection and Quarantine Administration of the“quality control”requirements for residue analysis.To sum up，homemade enzyme-linked immunity detection reagent box is convenient，fast operation，high sensitivity，and good repeatability.It is suitable for the rapid detection of a large number of samples.

aquatic products；malachite green（MG）；enzyme-linked immunosorbent assay；mandarin fish

TS207.4

A

1673-6004（2012）02-0058-04

* 沈麗，女，1972年出生，1995年畢業于華南師范大學，碩士，講師

2012-03-20