高效液相色譜法檢測酸牛乳中納他霉素含量的幾種前處理方法比較

鞏 強 李 波 田 夏

（山西省食品質量安全監督檢驗研究院，太原 030012）

·食品分析·

高效液相色譜法檢測酸牛乳中納他霉素含量的幾種前處理方法比較

鞏 強*李 波 田 夏

（山西省食品質量安全監督檢驗研究院，太原 030012）

在酸牛乳基質中分別添加0.64 mg/L、1.28 mg/L、3.2 mg/L、6.4 mg/L、12.8 mg/L5個濃度的納他霉素標準品。分別用幾種方法進行了酸牛乳樣品前處理，高效液相色譜儀測定，外標法定量。比較了幾種方法的回收率、檢出限及通過濾膜難易程度。結果表明：方法的回收率為66%～103%，檢出限為0.02 mg/kg～0.03 mg/kg。

納他霉素；前處理方法；比較

納他霉素（Natamycin），也稱游鏈霉素，是一種天然的多烯大環內酯類抗生素，是由納塔爾鏈霉菌（Streptomyces Natalensis） 經過發酵得到的一種次級代謝產物。他微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸及二甲苯甲酰胺，難溶于大部分有機溶劑，在pH值高于9或低于3時，其溶解度會有所提高，在大多數食品的pH范圍內非常穩定，是一種天然、廣譜、高效安全的酵母菌及霉菌等絲狀真菌抑制劑。它不僅能夠抑制真菌，還能防止真菌毒素的產生。納他霉素對人體無害，很難被人體消化道吸收，而且微生物很難對其產生抗性，同時因為其溶解度很低等特點，通常用于食品的表面防腐。納他霉素是目前國際上唯一的抗真菌微生物防腐劑。1997年我國衛生部正式批準納他霉素作為食品防腐劑。至今該產品已經在50多個國家得到廣泛使用，主要應用于乳制品、肉制品、發酵酒、飲料果汁、方便食品、烘烤食品等的生產和保藏。

納他霉素的測定方法主要有生物效價法、微孔板生物檢測法、紫外分光光度計法、元素分析法、比色分析法、薄層色譜法和液相色譜法等。生物效價測定法對實驗環境因素（溫度等）、材料因素（培養基等）、操作技術等條件要求高，操作過程也比較繁瑣；微孔板生物檢測法適用大批量的發酵液或樣品的檢測；紫外分光光度法一般用來做納他霉素檢測的常規對照，若將其用于定量分析，對實驗條件要求比較高；元素分析法、比色分析法和薄層色譜法主要用于納他霉素的定性分析；高效液相色譜法多集中于高純度納他霉素產品及食品中納他霉素殘留量的檢測分析，是一種行之有效的檢測手段。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫1260高效液相色譜儀；KQ5200 DE型超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；ELITIST 21K-R型離心機，長沙鑫奧儀器儀表有限公司；WH-2型漩渦振蕩器，江蘇城西曉陽電子儀器廠。

水為去離子水；甲醇為色譜純；濾膜，孔徑0.45 μm；納他霉素標準品，純度大于99.0 g/100 g；亞鐵氰化鉀溶液，10.6 g/100 g；乙酸鋅溶液，21.9 g和3 mL乙酸用水定容至100 mL。

1.2 標準溶液配制

準確稱量適量標準物質，用甲醇溶解并定容，配制成0.16 mg/mL標準溶液，4℃保存。根據需要用甲醇配制標準工作溶液。

1.3 樣品處理方法

方案一：稱取酸牛乳5.00 g（精確到0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入15 mL甲醇，超聲提取30 min，加水定容至25 mL，搖勻，冰箱冷凍1 h。取樣液過孔徑0.45 μm濾膜，進行液相色譜分析。

方案二：稱取酸牛乳5.00 g（精確到0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入甲醇15 ml，用水定容至25 mL，搖勻，超聲提取30 min，6000 r/min離心10 min。取樣液過孔徑0.45 μm濾膜，進行液相色譜分析。

方案三：稱取酸牛乳5.00 g（精確到0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入沉淀劑亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各1 mL，甲醇定容至25 mL，搖勻。取樣液過孔徑0.45 μm濾膜，進行液相色譜分析。

方案四：稱取酸牛乳5.00 g（精確到0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入沉淀劑亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各1 mL，甲醇定容至25 mL，搖勻，超聲提取30 min，6000 r/min離心10 min。取樣液過孔徑0.45 μm濾膜，進行液相色譜分析。

方案五：稱取酸牛乳5.00 g（精確到0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入沉淀劑亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各1 mL，甲醇定容至25 mL，搖勻，超聲提取30 min。取樣液過孔徑0.45 μm濾膜，進行液相色譜分析。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18 MG，250 mm×4.6 mm（i.d），5 μm；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min；等度洗脫；流動相：甲醇、水、乙酸體積比為60∶40∶5；檢測波長：305 nm；進樣量：10 μL。

2 結果與討論

方案一：優點是回收率高，回收率為100%～103%；缺點是上機前通過濾膜非常困難。

方案二：優點是回收率高，回收率為100%～103%；但仍然不能解決通過濾膜難的問題。

方案三：優點是通過濾膜容易，但回收率僅為66%～68%。

方案四：優點是通過濾膜容易，但回收率為74%～76%。

方案五：優點是通過濾膜容易，但回收率為80%～88%。

經分析，采用沉淀劑和離心方法可以使酸牛乳中蛋白質和脂肪組織結塊，有利于去除雜質，但隨之納他霉素的回收率會顯著降低；再加以超聲提取，能較好地提高回收率；冷凍方法去除脂肪的效果似乎不明顯，在實際檢測過程中，給過濾膜帶來很大困難，同時也對液相色譜儀的保護不利。5種方案所添加的最大濃度梯度范圍內均呈線性；5種方案的相關系數和相對標準偏差差異不顯著，但均能達到分析要求。

采用儀器自帶的軟件進行信噪比分析、推算，證實以上5種方案的檢出限為0.02mg/kg～0.03 mg/kg。這比GB/T21915-2008報道的0.5 mg/L要低。

3 小結

離心和加沉淀劑對去除酸牛乳雜質和樣液通過濾膜都非常有效，但會降低回收率。冷凍去雜的方法效果不明顯，樣液通過濾膜非常困難，不利于儀器的維護，但回收率較高。在具體的檢驗過程中可隨需要進行選擇。

［1］ 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T21915-2008國家標準——食品中納他霉素之測定液相色譜法［S］.北京：中國標準出版社，2008.

Comparison ofpretreatment methods in determination ofnatamycin content in sour Milk by HPLC

GONGQiang*LI BoTIANXia
（Food qualitysupervision and inspection research institute ofShanxi province，Taiyuan 030012，China）

Differentconcentrationsofnatamycinstandards （0.64mg/L，1.28mg/L，3.2mg/L，6.4mg/L，12.8mg/L）were added in sour milk.Several methods were used tothe pretreatment ofsour milk samples.Theyare assayed byHPLC and quantitative determined by external standard method.Recovery rate，detection limit,and the difficulty degree of filtration membrane were compared.Results showed that the recovery rate was between 66%～103%and the detection limit was 0.02 mg/kg～0.03 mg/kg.

natamycin；pre-treatment method；comparison

TS262.6

A

1673-6004（2012）02-0046-02

* 鞏強，男，1978年出生，2004年畢業于山西農業大學生物化學與分子生物學專業，碩士，工程師

2012-03-20