NADPH－氧化酶抑制劑二苯基碘對軟脂酸培養中胰島細胞的影響＊

中國醫科大學附屬第四醫院內分泌科（沈陽110000） 王 露 張 微 索琳娜

“脂毒性”是指血循環中游離脂肪酸濃度過高以及脂肪組織分泌的各種脂肪素含量增高所引起的致糖尿病作用。脂毒性對胰島β細胞的數量和功能均可產生不利影響。Moore等［1］指出軟脂酸鹽可以抑制胰島素分泌。其機制可能與氧化應激有關，而應用抗氧化劑能否減輕此反應也不完全清楚。本實驗應用軟脂酸培養胰島細胞，并進一步探討NADPH－氧化酶抑制劑二苯基碘（DPI）對此的影響。

材料與方法

1 材 料 細胞株和試劑：大鼠胰島細胞株INS－1（購自武漢大學細胞庫），軟脂酸購于美國Calbiochem公司，DPI購于美國CalBiochem公司；放射免疫法測定試劑盒購自解放軍總醫院科技開發中心放免研究所。

2 方 法

2．1 細胞培養：大鼠胰島細胞株INS－1培養于含10%%FBS的RPMI1640培養基中（含10%mmol／L Hepes，1mmol／L丙酮酸鈉，50μmol／L 2－ 巰基乙醇，100U／ml青 霉 素 和 100μg／ml 的 鏈 霉 素 ），置 于37%℃，5%CO2飽和濕度培養箱常規培養，將處于對數生長期貼壁生長的INS－1細胞用0．25%胰酶消化離心，用RPMI1640培養液制成單細胞懸液，并校正細胞濃度至1×106／ml。分別將INS－1細胞按1×105個／ml種植于24孔板內，分為①正常對照組；②軟脂酸組0．25mmol／L處理24h；③軟脂酸0．25mmol／L DPI處理組．孵育24h收集上清液，－20°C保存。

2．2 胰島素含量：采用放免法測定。

2．3 GSH－Px、MDA含量：采用比色法測定。

2．4 統計學分析：數據采用平均值±標準差表示，應用SPSS11．5對數據進行單因素方差（ANOVA）分析。

結 果

1 胰島素含量的比較：單用軟脂酸培養組的胰島素水平較對照組明顯降低（P﹤0．05），加用DPI干預后胰島素水平較單用軟脂酸組明顯增加（P﹤0．05），見附表。

2 GSH－Px、MDA含量的比較：單用軟脂酸培養組的GSH－Px含量較對照組明顯降低（P﹤0．05），加用DPI干預后明顯改善（P﹤0．05）。與對照組比較，單用軟脂酸培養組的MDA含量明顯增加（P﹤0．05），經DPI干預后明顯得到抑制（P ﹤0．05），見附表。

附表 各組胰島素及GSH－Px、MDA含量的比較

討 論

本研究應用軟脂酸培養胰島細胞發現胰島素水平明顯降低，進一步證明了游離脂肪酸對胰島細胞脂毒性的作用，脂毒性可以誘導胰島細胞凋亡［2］，影響胰島素分泌。Rao等［3］也發現將大鼠胰腺B細胞置入含有過氧化氫的環境中培養后，其凋亡數量較正常對照組明顯增加，過氧化氫濃度越高，凋亡數量越多。這其中的機制，目前比較公認的是由于內質網應激和氧化應激［4，5］。胰島是所有組織中對氧化應激最敏感的組織，胰島中抗氧化酶的含量在所有組織中是最低的。本實驗也研究發現軟脂酸培養組的GSH－Px含量明顯減低，MDA含量明顯增加，表明軟脂酸組氧化應激水平明顯增加。氧化應激時過剩的活性氧族可以直接對脂質、蛋白、溶酶體、DNA造成氧化損傷，大量氧自由基可使細胞膜脂質過氧化，線粒體膜形狀改變，導致線粒體功能障礙，生成減少，使質膜和肌漿網膜的鈣泵失活，導致細胞內游離的鈣離子增多，激活磷脂酶活性，使膜磷脂分解，導致B細胞凋亡。

抗氧化劑的應用是否能保護胰島細胞功能，到目前為止國際上也開展了各種研究，有學者用不同濃度的自由基清除劑MIC－186處理后，其抗胰腺B細胞凋亡的作用呈劑量效應關系，提示MIC－186對胰腺B細胞有保護作用［3］。此外Piro等［6］也研究發現能抑制活性氧簇的煙酰胺可以抑制游離脂肪酸誘導的胰島細胞凋亡。國內有學者應用N－乙酰半胱酸進行對胰島細胞的保護研究［7］，而氧化酶抑制劑DPI是否能保護胰島細胞，目前研究很少，動脈粥樣硬化是糖尿病的嚴重及常見并發癥，糖尿病的主要臨床特點是血糖升高，而高糖可以刺激血管產生氧化應激，損傷內皮細胞，誘發動脈粥樣硬化。探討氧化應激產生的機制，抑制活性氧的產生，對于防止糖尿病并發動脈粥樣硬化有十分重要的作用。NADPH氧化酶（NOX）是血管內皮細胞中活性氧產生的主要來源，而DPI是NADPH氧化酶的抑制劑。在本實驗中就發現加入DPI培養后，GSH－Px含量明顯增加，MDA含量明顯降低。

本研究發現NADPH－氧化酶抑制劑二苯基碘（DPI）顯著改善了由軟脂酸造成的胰島細胞分泌減少和氧化應激水平增加，這不僅說明氧化應激在胰島功能損傷中起一定作用，同時也為改善胰島功能損傷的治療提供了一條思路。

［1］ Moore PC，Ugas MA，Hagman DK，et al．Evidence against the involvement of oxidative stress in fatty acid inhibition of insulin secretion［J］．Diabetes，2004，53：2610－2616．

［2］ Unger RH，Zhou YT．Lipotoxicity of beta cells in obesity and other causes of fatty acid spillover［J］．Diabetes，2001，50（suppl 1）：s118－s121．

［3］ Rao P，Maeda H，Yutong X，et al．Protective effect of a radical scavenger，MCI－186on islet cell damages induced by oxidative stress［J］．Transplant Proc，2005，37：3457－3458．

［4］ Hansen M．Connecting endoplasmic reticulum stress to autophagy by unfolded protein response and Ca2＋［J］．Cell Death and Differentiation，2007，14：1576－1582．

［5］ Scherz－Shouval R，Elazar Z．ROS mitochondria and the regulation of autophagy［J］．Trends Cell Biol，2007，17：422－427．

［6］ Piro S，Anello M，Dipietro C，et al．Chronic exprosure to free fatty acids or high glucose induces apoptosis in rat pancreatic islets：possible role of oxidative stress［7］．Metabolism，2002，51：1340－1347．

［7］ 王 露，張 微，彭觀景，等．N－乙酰半胱酸對軟脂酸培養中胰島細胞的影響．陜西醫學雜志，2011，40：785－786．