淋巴結(jié)組織切片制作68例探討

陜西省榆林市第二醫(yī)院病理科（榆林719000） 李 萍

淋巴結(jié)皮質(zhì)和髓質(zhì)的細胞成分多，質(zhì)脆易損，加之外周包有一層比較致密的結(jié)締組織被膜。在常規(guī)制片中難度較大，如切片過厚，染色對比度差，組織易碎，各種試劑難以滲透，故而造成切片質(zhì)量較差，給診斷帶來困難甚至誤診。現(xiàn)將我們制作的68例切片報告如下。

材料和方法

1 材料選擇 收集2007年3月至2011年12月我院臨床手術(shù)切除的淋巴結(jié)組織68例，其中，鎖骨上及頸部淋巴結(jié)活檢標本12例，腹股溝淋巴結(jié)活檢標本13例，腹腔腸系膜淋巴結(jié)活檢標本21例，胃腸手術(shù)切除標本的區(qū)域淋巴結(jié)以及膽囊頸旁淋巴結(jié)各11例。

2 方 法 本制作步驟依次為：取材－固定－脫水－透明－浸蠟－包埋－切片－染色－封片。

2．1 取材：淋巴結(jié)的取材按常規(guī)進行，取材要求大小適宜，厚薄均勻，厚度最好在0．2cm左右，避免反復(fù)切修。在不破壞包膜的情況下，先將組織切開，切面向下固定。直徑大于2cm的淋巴結(jié)從中間剖開，取其一半或中間最大徑一片制作常規(guī)切片。盡量剝離干凈淋巴結(jié)外膜周圍的脂肪組織。

2．2 固定：臨床送檢的淋巴結(jié)組織及時浸入10%緩沖福爾馬林溶液中固定6～12h。

2．3 脫水：淋巴結(jié)組織應(yīng)從低濃度的70%乙醇脫水1h開始，逐步向80%乙醇脫水1h，95%乙醇1h，直至100%無水乙醇脫水1h。

2．4 透明：通常選用二甲苯做透明劑，透明過程應(yīng)均在振蕩器中進行，透明時間一般在20～30min之間，若在此時間內(nèi)還不能透明，則需稍稍加溫處理。

2．5 浸蠟：浸蠟石蠟熔點58℃～60℃之間，加以48℃ 熔點蠟和適量硬脂酸，浸蠟時間在4h左右。

2．6 包埋：石蠟溫度60～62℃ 。

2．7 切片、染色。切片時使用堅硬鋒利的一次性切片刀，厚度2～3μm，撈片水溫控制在43℃左右，將切片置于70℃溫箱中烤10min左右后，浸入松節(jié)脫蠟、梯度酒精處理、蘇木素染色3min，經(jīng)流水洗后，用鹽酸酒精分化1min，再次經(jīng)流水沖洗后，放入40℃溫水中返藍10min，最后采用伊紅復(fù)染片刻，梯度酒精脫水，用二甲苯透明，中性樹膠封片。

結(jié) 果

本研究所制68例淋巴結(jié)組織切片均為3～4μm的薄片，并連續(xù)成帶，包膜完整，無破碎，切片染色均勻，胞核呈藍紫色，胞漿呈鮮艷的紅色，胞核著色適中，組織細胞核仁、核膜結(jié)構(gòu)清晰，色彩對比度強，淋巴結(jié)皮質(zhì)、髓質(zhì)無擠壓，組織無刀痕、破碎、重疊、過染。

討 論

高質(zhì)量的淋巴結(jié)組織切片應(yīng)該是整個淋巴結(jié)的組織結(jié)構(gòu)中，基本形態(tài)清晰可見，各層次分明，細胞核染成藍色，細胞漿染成紅色，且核漿對比染色鮮明。但在實際的工作中不少淋巴結(jié)的組織切片染色不能令人滿意，有的切片偏厚，有的細胞核染色不良，模糊不清，部分切片出現(xiàn)“灰染”或“發(fā)白”現(xiàn)象，從而造成鏡下診斷困難。淋巴結(jié)組織結(jié)構(gòu)致密、細胞豐富，組織周圍又有一層較致密的結(jié)締組織包膜，因而在組織切片制作時，在脫水、透明、浸蠟?zāi)酥燎衅旧雀鱾€環(huán)節(jié)方面都要做到精準細致。

1 取材、固定：取材時，把新鮮淋巴結(jié)組織周圍的脂肪組織剔除，力爭取得完整淋巴結(jié)組織，并用鋒利的刀片將淋巴結(jié)組織沿其長軸剖開，取0．5～2．0cm厚的組織。由于淋巴結(jié)本身細胞成分非常豐富，組織質(zhì)脆易損，刀鈍容易使淋巴結(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)受擠壓。因此，取材刀必須鋒利，以避免人為的機械擠壓，導(dǎo)致顯微鏡下細胞結(jié)構(gòu)的變化［1］。

淋巴結(jié)組織外包一層致密的結(jié)締組織被膜，且細胞豐富致密、間質(zhì)成分少，使得固定劑在短時間內(nèi)很難浸透到組織內(nèi)，因此合適取材剖開，取其一半或中間最大徑一片后，立即投入10%福爾馬林固定。若取材時組織標本已發(fā)生自溶而沒有及時固定，會使組織的結(jié)構(gòu)模糊不清，出現(xiàn)“灰染”和“發(fā)白”。若標本在取材之前已干枯，標本經(jīng)切片染色后，在干枯區(qū)域也會造成成片的“灰染”或“發(fā)白”［2］。一般采用福爾馬林固定液固定6～12h，如果固定液濃度過高或固定時間過長，就會使組織變硬，減弱了脫水劑對組織的滲透能力；如果濃度過低或時間過長，組織太軟不易切片［3］。

2 脫水、透明、浸蠟、包埋：組織脫水就是將組織內(nèi)存在的水分除去，由于淋巴結(jié)組織完整的被膜阻礙脫水劑的滲入，所以在選擇脫水劑時，應(yīng)該首選脫水能力較強的乙醇溶液，但盡量不用丙酮之類的強脫水劑，以減輕組織細胞的收縮程度［4］。淋巴結(jié)組織脫水應(yīng)從低濃度的70%酒精直至100%酒精進行，每步一般在l～5h。如果脫水時間太短，就會使組織內(nèi)的水分不易被置換出來，影響透明和浸蠟；如果脫水時間過長，會使組織變硬、變脆，減弱了透明劑對它的滲透能力。

透明劑通常用二甲苯，因為它透明力強，能使光線穿透組織，它既能與脫水劑相融，又能與石蠟混合。透明時間一般在20～30min，若在此時間內(nèi)還不能透明，則需稍稍加溫處理。

浸蠟是為了除去組織中的二甲苯，并能使石蠟浸透到組織內(nèi)部，使組織有一定的硬度，有利于切片，浸蠟石蠟的熔點在58～60℃之間，加以48℃ 熔點蠟和適量硬脂酸，浸蠟時間在4h左右，若浸蠟時間過短，石蠟分子在組織內(nèi)沒有充分飽和，使組織與石蠟結(jié)構(gòu)不嚴，給切片帶來困難，若時間太長，則使組織變硬，同樣不利于切片。蠟的熔點過高會導(dǎo)致組織內(nèi)出現(xiàn)裂縫，或?qū)е陆M織周圍變硬而中心浸蠟效果不佳。

將浸好蠟的組織立即包埋于60～62℃的石蠟中。包埋時組織內(nèi)外的蠟要保持溶解狀態(tài)。鑷子的溫度要稍高于蠟溫。夾取組織塊將切面向下，放于包埋框內(nèi)，并用鑷子輕輕壓平。

3 切片、染色：了能更好的顯示淋巴結(jié)組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)，切片時最好使用堅硬鋒利的一次性切片刀、無“豁牙”，及時清除切片刀上的蠟屑，保持刀刃的清潔。進刀力度要均勻，以求切片的薄而完整，切片厚度在2～3μm之間，切片過厚，染片中容易掉片。也要準確掌握烤片的溫度，過低容易掉片，過高影響染色。一般以70℃溫箱30min。組織染色時要縮短蘇木素染核和伊紅染漿的時間，相應(yīng)延長鹽酸酒精分化和溫水返藍的時間，這樣制出的淋巴結(jié)切片染色質(zhì)才顯示較好，胞漿和胞核對比分明，組織結(jié)構(gòu)清晰。

［1］ 郭海淵．提高淋巴結(jié)組織切片質(zhì)量的體會［J］．柳州醫(yī)學(xué)，2011，24（3）：161－162．

［2］ 蔡瓊珍．提高淋巴結(jié)組織切片質(zhì)量的體會［J］．廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，23（6）：695－696．

［3］ 王 玨，張 健，朱禮國．影響淋巴結(jié)組織切片質(zhì)量的處理方法［J］．鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，26（6）：122．

［4］ 吳 瑤，吳 鵬，潘曉蔚．等．高質(zhì)量組織切片的制作要點與體會［J］．沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，6（3）：164－l65．