缺血預處理對局灶性缺血大鼠腦梗死區周圍TLR4及GFAP表達的影響*

胡曉松，宋海星，劉 靜，楊 拯，李 鑫

(成都醫學院：1.基礎醫學實驗教學中心；2.人體解剖學教研室,成都 610083)

近10年來人們對腦缺血臨床治療做了大量深入的研究，但真正能從基礎研究應用到臨床的神經保護治療措施仍然甚少。腦缺血耐受(brain ischemic tolerance，BIT)是機體對損傷刺激固有的應激和防御反應，也是已知的內源性保護機制中作用最強大的。腦缺血預處理(cerebral ischemic preconditioning，CIP)是指預先給予一個短暫、非致死性的輕度腦缺血打擊之后，將對致死性的缺血產生耐受[1]，但其作用機制目前仍不甚明了。星形膠質細胞(astrocyte，AST)作為神經元最重要的功能伙伴，雖然近年來AST在腦缺血領域得到廣泛關注，但有關其在BIT中的作用卻一直未得到足夠的重視。本實驗通過研究 Toll樣受體4(toll-like receptor4，TLR4)及膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)在CIP后腦缺血梗死區周圍的表達變化,旨在探討AST活化在BIT誘導機制中的可能作用。

1 材料與方法

1.1動物分組 健康SD 大鼠，雄性，清潔級，體質量250～300 g 共45只。大鼠隨機分為：(1) CIP組，給予CIP 20 min,3 d 后給予大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO) 2 h,再灌注6、24、72 h；(2)MCAO組，未行CIP,單純暴露動脈處的解剖結構20 min(假手術),余同CIP 組；(3)假手術組，兩次均為假手術,均為暴露解剖結構,未進行缺血處理。每組各時間點5只。

1.2動物模型的制備 大鼠術前12 h禁食不禁水，以4%水合氯醛腹腔內注射麻醉(7.5 mL/kg)，置仰臥位，于頸部行長約25.0 mm常規縱行切口。暴露并鈍性游離右側頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)及頸外動脈(ECA)，結扎ECA遠側端，動脈夾夾閉CCA近心端，在結扎線近端距分叉5 mm 處剪一約0.2 mm小口。用浸于2.5×106U/L肝素鈉的長6 cm、直徑0.26 mm、頭端圓鈍的尼龍線從ECA殘端插入,經CCA分叉部進入ICA約(19.0±0.5)mm，直至感覺有阻力時，即阻斷大腦中動脈(MCA)入口處，結扎ECA近端。20 min 后輕輕抽出栓線約10 mm形成第1 次再灌注,固定尼龍線并全層縫合切口。3 d后再次麻醉大鼠,找到ECA結扎處，重新剪口插線阻斷MCA，結扎ECA的近心端，并留置尼龍線于體外,縫合皮膚。2 h 后抽出栓線,形成第2 次再灌注。

1.3神經病學評分及MCAO模型成功的判斷標準 MCAO模型成功的納入標準參照Longa 法[2]，0分：無神經功能缺損癥狀；1分:輕度局灶性神經功能缺損(不能完全伸展右前肢)；2分：中度神經功能缺損(向右側轉圈)；3分，重度神經功能缺損(向右側傾倒)；4分，不能自發行走，意識水平降低。動物出現神經功能缺損，無煩躁不安、抬頭狂體征，評分在1～3分者納入。

1.4取材制片 大鼠腦缺血2 h、于再灌注預定時間點麻醉后，用生理鹽水經主動脈快速沖洗至右心耳流出液變清亮，迅速斷頭取腦(摒棄蛛網膜下腔出血者)，立即置于-20 ℃冰箱冷凍10 min，用腦切片器按2 mm厚度切片，選取距前囟點(Bregma)約1.4～-0.6 mm的腦片行免疫組織化學染色。4%多聚甲醛固定12～24 h后行脫水、透明、石蠟包埋。切片厚度5 μm。

1.5固定、取材、切片 動物在麻醉后開胸，經升主動脈插管，先用生理鹽水150 mL沖去血液，繼而灌注含4%多聚甲醛的0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH7.4) 300 mL，注畢立即取腦組織行后固定6～24 h，石蠟包埋。

1.6免疫組織化學染色 免疫組織化學采用即用型二步法，TLR4(1∶200，Abcam公司)及GFAP(1∶500，Chemicon公司)，二步法試劑PV-6002由北京中杉金橋生物公司(美國Zymed公司分裝產品)提供。陰性對照用正常血清代替一抗。

1.7圖像分析及統計學處理 陽性表達為結構完整、定位明確的著色較深(棕褐色)的細胞。切片在統一放大倍數(×400)下，隨機選6個視野，輸入Image pro-plus6.0圖像分析系統，記取平均陽性細胞數。實驗結果行方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠腦梗死灶周圍GFAP的表達 鏡下GFAP陽性細胞可見兩種類型，一種胞核腫脹、突起粗短、深染，主要分布于梗死區周圍；另一種突起長而纖細，主要分布于缺血側胼胝體、非缺血側腦組織。此外，小血管和微血管壁，腦室脈絡膜和室管膜上皮亦有表達。假手術組GFAP表達較少，且較弱，少量小血管和微血管內皮細胞呈陽性反應。再灌注6 h，即見GFAP明顯表達，并隨再灌注時間延長，有表達逐漸增強的趨勢，再灌注72 h達到峰值。在缺血梗死區周圍GFAP陽性細胞呈圍繞梗死區的多層分布，突起深染、粗短，少數突起伸長、交織(彩插Ⅱ圖1)。此外，側腦室背外側角可見較多沿胼胝體長軸平行排列的GFAP陽性細胞，突起較長，多伸向缺血梗死區。與MCAO組比較，同時間段CIP組GFAP陽性細胞數目明顯較多(P<0.05)。據觀察再灌注對照側室管膜下區、紋狀體、胼胝體等部位亦有GFAP膠質細胞樣表達，但數目較缺血側明顯減少見圖2。

2.2各組大鼠腦梗死灶周圍TLR4的表達 TLR4陽性細胞主要表達于缺血側紋狀體、胼胝體、大腦皮質等處的神經膠質細胞、神經元及炎細胞等處。假手術組僅見微血管壁及脈絡叢上皮、室管膜上皮等處的弱表達，TLR4陽性表達產物在細胞質。再灌注6 h起，在MCAO組，即見TLR4明顯表達，并達高峰。再灌注72 h組梗死灶周圍見較多成簇分布、體積增大胞漿較淡的小膠質細胞，即格子細胞(gitter cell)，多數胞漿中有TLR4顆粒狀表達。此外，TLR4膠質細胞樣陽性細胞可見核腫脹及較短突起，顆粒細胞及錐體神經元均見TLR4的胞漿表達(彩插Ⅱ圖3)。CIP組TLR4與相應時間段MCAO組比較，均明顯下降(P<0.05)，見圖4。隨再灌注時間延長，TLR4表達逐漸降低。

*：P<0.05，與MCAO組比較。

*：P<0.05，與 MCAO組比較。

3 討 論

腦缺血后，炎癥反應是神經元死亡的重要機制，并貫穿整個腦缺血損傷的始終[3]。TLR4 作為門戶蛋白啟動機體的炎癥鏈式反應，在跨膜信號轉導受體家族TLRs 中占有重要的位置[4]。研究表明，TLR4主要通過識別結合細菌LPS、HSPs、HMGB1、透明質酸等配體介導MyD88依賴和TRIF依賴的信號轉導通路，從而誘導IL-1、IL-6、IL-12、IL-8、IL-10、TNF-α及 IFN-γ、MMP-9、iNOS、COX-2等與腦缺血密切相關的炎性介質的釋放[5-6]。

CIP可激發機體內源性神經保護機制，從而減輕腦缺血再灌注損傷的嚴重程度。本實驗結果顯示，與假手術組比較，CIP組及MCAO組的TLR4表達均于缺血再灌注早期(6 h)即達峰值，并隨再灌注時間延長呈下降趨勢；與MCAO組比較，同時間段CIP組TLR4陽性細胞數目均顯著，結果證實預先給予一次短暫的CIP即可在腦缺血損傷早期抑制TLR4介導的炎性信號通路的過度活化。此外，本研究結果表明，TLR4主要表達于缺血側紋狀體、胼胝體、大腦皮質等處，陽性細胞主要為小膠質細胞，與Laflamme和Rivest[7]報道結果不同的是，本實驗還發現TLR4在以上腦區的神經元和AST表達，該結果與Tang等[8]報道的一致。作為非傳統意義上的炎性反應細胞，神經元和AST表達炎性信號蛋白分子，的確使人費解。有研究發現[9]，神經元TLR4激活后，可引起P38-JNK/AP-1通路活化、炎性因子釋放、脂質過氧化、凋亡等損傷過程，而TLR4缺陷小鼠的皮質神經元在體外糖剝奪培養中有更高的生存率[8]，結果表明神經元自身分布的TLR4對其存活有重要影響。

生理狀態下，AST在提供CNS代謝和營養支持、維持正常神經元功能、參與血腦屏障、調節突觸活性等方面發揮重要作用[10-12]。腦缺血后，興奮性谷氨酸釋放、胞外離子失衡、即早基因(c-fos、c-jun 等)的表達上調等因素引起AST的廣泛激活并表達其標志蛋白GFAP，活化的AST向神經元傳遞乳酸鹽、丙酮酸鹽、糖原等能量物質，并積極清除細胞外興奮性氨基酸，從而發揮微調節神經元微環境作用。此外，AST還可通過合成NGF、減少自由基形成、抑制白細胞和血小板的黏附聚集、抑制細胞凋亡、減少鈣超載等效應，以及參與神經元突觸的生成等環節發揮神經保護和促神經修復的作用[13]。本研究結果顯示，無論CIP組還是MCAO組，隨著再灌注時間延長，腦梗死灶周圍GFAP的表達均有增加趨勢，與MCAO組比較，同時間段CIP組GFAP陽性細胞數目明顯較多，鑒于AST在神經元保護中的重要作用，有理由相信這種早期CIP引發的AST活化參與了BIT的發生過程。同時，本實驗也提示GFAP表達上調的激發與維持并不完全依賴TLR4信號通路的活化，該過程是否有其他TLRs(如TLR2、TLR9)參與、AST的GFAP表達增強與其神經保護功能的具體機制等問題尚需進一步研究。

[1]Plamondon H,Davignon G,Khan S.Cerebral ischemic preconditioning induces lasting effects on CA1 neuronal survival,prevents memory impairments but not ischemia-induced hyperactivity[J].J Behav Brain Res,2008,189(1):145-147.

[2]Longa EZ,Weinstein PR,Calson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-86.

[3]龔彪，李長清，黃劍．大鼠線栓法局灶性腦缺血/再灌注模型的改進[J]．重慶醫學，2006，35(4)：313-316.

[4]金生，張大志，陳壓西.Toll樣受體研究進展與臨床免疫[J].重慶醫學，2004,33(9):1423-1424.

[5]Kielian T.Toll-like receptors in central nervous system glial inflammation and homeostasis[J].J Neurosci Res,2006,83(5):711-713.

[6]Hyakkoku K,Hamanaka J,Tsuruma K,et al.Toll-like receptor 4(TLR4),but not TLR3 or TLR9,knock-out mice have neuroprotective effects against focal cerebral ischemia[J].Neuroscience，2010，171(2):258-261.

[7]Laflamme N，Rivest S．Toll-like receptor 4：the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram negative bacterial cell wall components[J]．Mol Immunol，2005，42(2)：155-157.

[8]Tang SC,Arumugam TV,Xu X,et al.Pivotal role for neuronal Toll-like receptors in ischemic brain injury and functional deficits[J].Proc Natl Acad Sci，2007,104(6):798-801.

[9]Thiruma V,Arumuga M,Okun E,et al.Toll-like receptors in ischemia-reperfusion injury[J].Shock，2009，32(1):4-6.

[10]Feeney CJ,Stys PK.Astrocyte:response to injury[J].J Encyc of Neurosci,2009,58(7):837-839.

[11]張敬軍．星形膠質細胞的研究[J]．中國藥理學通報，2006，22(7)：788-790.

[12]Benarroch EE.Astrocyte-neuron interactions:Implications for epilepsy[J].J Neurology,2009,73(16):1323-1325.

[13]Moxon-Emre I,Schlichter LC.Evolution of inflammation and white matter injury in a model of transient focal ischemia[J].J Neuropathol Exp Neurol,2010,69(1):1-3.