PCR-DGGE對新生兒壞死性小腸結腸炎腸道菌落結構及其動態性研究

鄭樹芳，徐艷珍，艾 青，余加林

(重慶醫科大學附屬兒童醫院新生兒科/兒童發育疾病研究省部共建教育部重點實驗室/兒科學重慶市重點實驗室/重慶市兒童發育重大疾病診治與預防國際科技合作基地 400014)

新生兒壞死性小腸結腸炎(neonatal necrotizing enterocolitis,NEC)是新生兒特別是早產兒的急腹癥，臨床以腹脹、嘔吐、便血、嚴重休克為表現，X線片檢查以腸壁囊樣積氣為特征。本病在國內的病死率約10%～50%，在美國病死率足月兒為5%，早產兒特別是體質量小于1 000 g的患兒可高達50%[1-2]。NEC是多因素的疾病，細菌感染是其中一個不可缺少的致病因素。有研究表明，NEC尚未發生在無菌的動物模型上[3]。也有假說表明新生兒腸道異常細菌的定植是NEC發生的一個重要因素,特別是在生后8～10 d的新生兒的腸腔內厭氧菌落開始定植生長[4]。但目前國內外對NEC腸道細菌感染的細菌成分和動態性變化尚無清晰的了解。傳統方法學是采用培養技術來研究腸道微生態。據估計腸道內有60%～80%的細菌是不可培養或者難以培養的[5],遠遠低估了細菌的多樣性，不能滿足現在研究的需要。DGGE是通過對不同序列的DNA片段在不同濃度的變性劑下發生變性來進行分離，能夠有效地克服傳統培養法分析微生物菌落的不足。本實驗采用PCR-DGGE技術來研究NEC腸道微生態組成和動態變化，為NEC疾病的發病機制和臨床防治提供細菌學理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗對象 從重慶市兒童醫院新生兒病房2009年8月至2009年12月共收治32例，NEC組和對照組各16例；其中NEC組按照臨床診斷標準：臨床癥狀(腹脹、嘔吐、腹瀉、血便等),體格檢查(腹脹、腸鳴音減弱等)，大便常規加隱血實驗(+)以及X線片檢查情況(有腸道動力學改變、腸壁積氣、門靜脈積氣、氣腹、膈下游離氣體)之一；所有納入的病例均有大便隱血(+)及X線片檢查(+)。根據國際Walsh和Kliegman的BELL對于NEC疾病的分期標準[6]，收集的NEC病例均為Ⅰ期(輕度)。對照組是基礎疾病，臨床特征盡量匹配，見表1。收集實驗對象入院后不同時期的糞便標本。

表1 NEC組和對照組的臨床資料比較(n=16)

1.2標本的準備和保存，糞便細菌DNA的提取 本實驗收集的新生兒新鮮糞便0.22 g，保存在-70 ℃冰箱。大便細菌DNA的提取參照QIAamp Stool Mini Kit(QIAGEN,德國)的說明書，總菌DNA提取后用可見紫外分光光度儀測定DNA樣品濃度和純度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.3對于糞便細菌DNA進行PCR擴增 采用引物擴增16S rDNA v3高變區，引物為帶有“GC”帽的357F-GC和518R,其中V357F-GC(5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′)，518R(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)由上海英駿生物工程技術服務有限公司合成。PCR擴增體系(50 μL)：上下游引物各2 μL(10 μmol/L)，DNA模板 5 μL，premix 25 μL(寶生物提供)，滅菌去離子水補充至50 μL。反應條件：94 ℃ 2 min,94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環,72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖電泳檢測PCR產物擴增效果。

1.4糞便細菌DNA進行PCR-DGGE，割膠回收DNA進行測序 采用BIO-RAD Dcode Universal Mutation System DGGE電泳系統進行DGGE分析，聚丙烯酰胺凝膠濃度是8%，變形梯度從上到下采用35%～65%；上樣量為25 μL。其運行條件是：1×TAE電泳緩沖液，60 ℃電泳條件下，85 V，16 h。電泳完畢后， SYBR GREEN Ⅰ染色30 min。將染色后的凝膠用Bio-RAD的GELDOC-2000凝膠影響分析系統拍照；在BenchTop 3 UV紫外透射儀下進行優勢條帶割膠，回收細菌DNA。進行無帽PCR擴增，將其產物送往華大基因測序，測序結果于NCBI上進行Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比對分析。

1.5統計學處理 實驗病例的數據使用SPSS17.0統計軟件分析，其中胎齡、出生體質量、抗菌藥物用藥時間的數據符合正態分布，采用t檢驗；性別、生產方式、喂養方式數據為計數資料，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1NEC組和對照組的臨床資料 見表1。

2.2腸道總菌DNA的PCR-DGGE圖譜顯示 不同泳道間條帶分布模式有一定的相似，但某些條帶亮度、粗細差異也有比較明顯的差異性，說明對應其在DGGE膠上的密度大小是不同的。條帶比較粗亮，說明細菌密度大；條帶比較細淺則細菌密度小。DGGE條帶的數量基本體現了腸道細菌種群的數量，而條帶的亮度則反映該種細菌數量的多少(圖1)。從圖1可以看出，共檢測到數量不等的16S rDNA V3區條帶，每個泳道的條帶數量都較多且不等，充分顯示出新生兒腸道細菌的多樣性(表2)。

A～T列代表圖中20個樣本泳道，其中A～E代表對照組1號的連續不同時間的結果，F～J代表著NEC1號，K～N代表對照組2號，O～T代表NEC2號。

圖1對照組與NEC組的DGGE圖

表2 DGGE膠回收的優勢細菌DNA測序比對結果

表3 DGGE圖譜中不同泳道在quantity one軟件可檢測的條帶數即豐富度(S)

糞便腸道細菌Shannon指數衡量細菌的多樣性，細菌的多樣性代表細菌菌種的多少和均勻度。菌種種類越多,各個種的數量分布越均勻,菌種多樣性指數越大。實驗后,對DGGE 圖譜進行軟件分析后進行Shannon指數計算。結果如表3及圖2。統計軟件分析對照組和NEC組的豐富度和多樣性指數，如表4,兩組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 DGGE多樣性分析的Shannon指數(H′)

圖1表明，對照組的腸道菌種動態性分布比較均一，多樣性指數較小，而NEC組在開始發病初期，多樣性指數明顯高于對照組，分布不均。隨著疾病的治療進展，多樣性指數有明顯的降落；隨著疾病的恢復，多樣性指數緩慢回升。所以，作者發現NEC疾病初期，細菌多樣性指數較對照組高，腸道細菌菌種多樣性更為明顯。

2.3對照組與NEC組的DGGE圖片分析 得出同上趨勢的有13/16(81.25%)。3/16(18.75%)趨勢不明顯，Shannon指數差異不大。對照組和NEC組腸道細菌種屬區別不大(表5)。

表5 對照組與NEC組檢測到的細菌情況(n=16)

3 討 論

正常胎兒的消化道是無菌的。在分娩過程中和以后，母親和周圍環境的微生物選擇性地定植在新生兒的消化道里，直到一個密集的、復雜的腸道微生態的形成。異常的腸道細菌定植和腸道微生態菌落的紊亂會嚴重影響新生兒階段的健康，導致各種疾病的發生、發展。另外，腸道菌群不同還會影響宿主對于藥物的反應不同，根據藥理代謝組學研究，腸道菌群結構的差異產生的宿主代謝表型可以用于預測宿主對于藥物的不同反應[7]。

新生兒NEC是新生兒期間最嚴重的腸道系統的疾病之一。任何胃腸道生態系統的異常都可能導致發生NEC[8]。國內外研究均表明，用腸道益生菌制劑干預能有效地減少NEC的發病率，也能明顯減少發病后的NEC的嚴重程度和縮短病程時間，減少病死率[9-12]。現在推測，胃腸道共生細菌的紊亂和致病細菌的定植是NEC的發病機制之一。但以前研究中使用細菌培養并沒能有效地解釋NEC中細菌感染的發病機制。據報道，80%的人類結腸菌群是傳統培養法無法檢測到的[13]。

因此，本研究用分子生物學技術PCR擴增幾乎所有細菌(包括能夠培養和目前不能培養的細菌)的16S-rDNA片斷，然后通過DGGE區分不同的菌種和相對數量，來研究NEC疾病發展中腸道細菌組成及其動態發展。本研究表明對照組的患兒隨著基礎疾病的治療，腸道菌落呈動態性的變化，條帶數和Shannon指數均較為均一分布，呈穩態增多的趨勢，較符合正常新生兒腸道微生態的發展規律。而大部分NEC組的患兒在發病初期的條帶數和Shannon指數明顯高于對照組，分布明顯不均，在治療過程中，有跳躍式的降低，在疾病恢復期，又有所回升，呈大起大落后緩升趨勢。根據割膠回收后測序的結果顯示，NEC組和對照組的腸道菌屬區別并不大，并沒有發現特定的細菌與NEC發病相關。因此，推測NEC發病中特定相關的致病菌并非其發病的主要原因；原本平衡的腸道菌落因為某些危險因素而導致腸道菌落數量比例失衡是NEC發病機制中的重要因素，這與國外的研究相一致。Mshvildadze等[14]發現NEC組與對照組的腸道微生態并沒有顯著的區別，腸道菌落紊亂是其發病的重要原因，但同時也報道NEC較對照組在發病初期，腸道細菌多樣性降低，跟本研究中的結論相反。本研究中NEC組的抗菌藥物使用時間比對照組長(P<0.05)，抗菌藥物為廣譜抗菌藥物加上二代頭孢，可能導致腸道細菌紊亂。測序結果發現NEC腸道細菌跟對照組均以肺炎克雷菌屬、大腸埃希菌屬、腸球菌屬為優勢菌群，偶在某些個體中發現梭菌屬和乳球菌屬，兩組優勢菌群無太大差異。這些菌屬均在國外研究NEC的相關文獻中提及過。另外，國外也報道過NEC發病可能與產氣莢膜梭菌屬、葡萄球菌屬相關，這個可能與本實驗納入的NEC的發病程度輕、地區差異、試驗檢測手段的不同有關。產氣莢膜梭菌屬可能與NEC的腸段壞死、腸壁間積氣有關，在NEC發病的分期中屬于Ⅲ期(重度)。當然，不同國家不同地區的腸道菌落存在區域性，這與飲食習慣、地域環境、人種均有關。同時，目前DGGE靈敏度存在一定局限，只能檢測糞便中大于1%的優勢菌種[15]。

新生兒出生后，腸道微生態是個動態的復雜過程，與個體、環境、喂養等相關，每個新生兒的腸道菌落均呈個體發展，這些無疑是新生兒期間腸道微生態研究的一個難點所在。PCR結合DGGE是目前觀察腸道菌落變化的有效手段。本研究因為早產兒例數不足以比較早產兒跟足月兒NEC的腸道菌落是否存在差異性；納入的患兒均為Ⅰ期NEC，未能深入觀察不同發病程度的患兒間是否也存在腸道菌種的差異。后期實驗還可深入觀察NEC發病的各危險因素是否導致腸道微生態的規律性的差異；腸道細菌的代謝與腸道黏膜屏障和腸道免疫的相互作用等。另外，DGGE只能粗略的半定量，后期可以結合q-PCR更為準確地評估所測到的菌種數量的差異，探討不同菌種對于疾病發展的可能作用，對于NEC的患兒腸道菌落整體更為清晰的了解，指導繼續深入研究；同時，腸道細菌作為一個潛在的藥物靶點，也為今后的臨床個性化治療方案提供新的研究方向。

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