烏司他丁抑制人乳腺癌細胞的侵襲和轉移及其分子機制*

王 寧，崔曉江，孫治君△

(1.重慶醫科大學附屬第二醫院三腺外科 400010; 2.外科系,女性癌癥研究中心/塞繆爾-奧斯欽綜合癌癥研究所/塞德斯-辛奈醫學中心，美國，加利福尼亞州，洛杉磯 90048)

乙酰肝素酶(Heparanase，Hpse)是一種內源性-β-D-葡糖苷酶，通過裂解硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)中的硫酸乙酰肝素(heparan sulfat,HS)側鏈降解細胞外基質(extracellular matrix,ECM)和基底膜(basilar membrane,BM)，加快腫瘤細胞的侵襲和轉移。透明質酸酶(hyaluronidase,Hyase)可以降解透明質酸(hyaluronic acid,HA)為寡聚透明質酸(OligσHA)。CD44為HA細胞表面受體，透明質酸酶和分解的透明質酸片段可以通過CD44受體影響腫瘤細胞的增殖遷移和血管形成，在腫瘤發展及轉移中起重要作用[1]。烏司他丁(Ulinastatin,UTI)是一種蛋白酶抑制劑，有抑制各種酶活性的作用，常用于重癥胰腺炎的治療。本課題組前期研究顯示烏司他丁能抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移，促進細胞凋亡,同時可增強抗腫瘤藥物的效果[2-3]。CD44v6是CD44的一種變異體，本實驗主要通過測定烏司他丁對乙酰肝素酶、1型透明質酸酶和HA受體CD44v6的表達影響探討其抑制乳腺癌細胞侵襲及轉移的分子機制。

1 材料與方法

1.1主要實驗材料及試劑 乳腺癌MCF-7(ER陽性)及MDA-MB-231(ER陰性)2個細胞系由重慶醫科大學病理教研室免費提供。胎牛血清及RPMI-l640購自浙江省杭州四季青生物工程材料有限公司。Heparanase兔抗人抗體購自美國Santa公司，Hyaluronidase-1及CD44v6鼠抗人單克隆抗體均購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔lgG抗體購自北京博奧森公司。泰索帝(TXT)購自杭州賽諾菲安萬特民生制藥公司,烏司他丁購自廣東天普生化醫藥股份有限公司，藥物濃度分別配成100×血漿峰濃度(peak plasma concertration，PPC)備用。實驗使用藥物濃度參考文獻：烏司他丁分別為 400、800、1 600 U/mL 3個濃度組，泰索帝3.7 μg/mL。

1.2細胞的培養及傳代 2個乳腺癌細胞系的細胞分別置于25 cm2玻璃培養瓶培養，瓶內均加入RPMl-l640培養液4 mL(包括10%胎牛血清)，置于37 ℃、5.0%CO2培養箱中培養。細胞處對數生長期(細胞長滿培養瓶底面積約80%以上)時傳代培養。傳代：棄培養液，PBS液洗滌瓶底2次并棄液，加入0.25%的胰酶1 mL消化1 min后吸管吸掉胰酶，繼續消化2～3 min，加1 mL RPMl-1640液停止消化后吹打收集細胞，離心，分裝培養瓶后各加入RPMl-l640培養液，置培養箱中繼續培養。

1.3細胞實驗分組及給藥 培養傳代后處于對數生長期的MCF-7及MDA-MB-231細胞分別分為5組(具體細胞量根據實驗需求)并最終調節加藥濃度：空白對照組、UTI低劑量組(400 U/mL)、UTI中劑量組(800 U/mL)、UTI高劑量組(1 600 U/mL)、UTI聯合TXT用藥組(UTI 800 U/mL+TXT 3.7 μg/mL)，空白對照組加入等體積的生理鹽水，培養箱繼續培養。

1.4Western blot檢測細胞乙酰肝素酶、透明質酸酶1和CD44v6蛋白 將置于25 cm2培養瓶培養的處于對數生長期的2個細胞系細胞各分5個實驗組，分別以UTI 400、800、1 600 U/mL 3個組及3.7 μg/mL TXT+UTI 800 U/mL組藥物單獨或聯合處理，空白對照組加等量生理鹽水，孵育細胞24 h后吸棄培養液，用PBS漂洗2～3次，加入100 μL細胞裂解液，冰上放置約30 min，期間可混勻幾次。升至4 ℃,用細胞刮刮下細胞收集于1.5 mL EP管，以12 000 r/min,離心15 min。收集上清液，用Bradford法測定各組裂解液中蛋白質濃度，于-70 ℃儲存備用。根據蛋白定量結果加入相應體積的總蛋白樣品與5×蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液，混合后于95 ℃變性10 min，立即插入冰中待用。分別配置分離膠和濃縮膠。樣品加至凝膠孔中行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，用濕式轉印法將PAGE膠上的蛋白轉至PVDF膜上，轉移膜置于封閉液中，室溫、搖床上緩慢搖動狀態下封閉1 h，加入一抗(Heparanase兔抗人抗體、Hyaluronidase-1及CD44v6鼠抗人單克隆抗體，1∶1 000稀釋)，4 ℃反應過夜，洗膜，將二抗用1×TBST緩沖液稀釋3 000倍，加入二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體)。室溫、避光緩慢搖動1 h，洗膜。最后用DAB顯色，使用凝膠圖像處理系統分析目標帶凈光密度值，統計并做記錄。

1.5Matrigel侵襲實驗檢測細胞的侵襲 冰上用預冷的移液槍吸取100 μL Matrigel加入預冷的300 μL無血清培養基中，充分混勻，取稀釋過的Matrigel 25 μL加入24孔板的Transwell上室，置于孵箱，37 ℃，30 min使Matrigel聚合成膠。按計劃每種細胞設置5組，每組設6個復孔。培養板Transwell上室中加入100 μL細胞懸液(4×104個)同時加入無血清培養基200 μL；每個下室加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液400 μL，放入37 ℃,5%CO2孵箱，培養24 h。PBS輕洗小室上室并用移液槍棄液，濕棉簽輕擦去除小室上室的細胞和Matrigel膠；加入500 μL 0.1%結晶紫溶液，將小室膜浸沒在其中，置于37 ℃，5%CO2培養箱中孵育30 min，加入500 μL 33%醋酸至浸沒小室膜，低速振蕩10 min，充分溶解結晶紫。取出小室后將24孔板置于酶標儀上570 nm波長下測光密度值(OD值)，間接反映細胞數；此實驗重復3次。

1.6Transwell細胞跨膜實驗檢測細胞的遷移 取處于對數生長期的各處理組及對照組細胞，用PBS液和無血清培養基洗滌細胞幾次，消化細胞，用無血清RPMI-1640液制備細胞懸液，計數并調整細胞數為2×105/mL；取細胞懸液50 μL加入上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，各組設置6個復孔。培養板于37 ℃，5%CO2培養箱培養24 h。取出小室并用移液槍吸干上室液體，棉簽擦去上室未遷移的細胞，移至預先加好的4%多聚甲醛孔中固定30 min；吸干上室固定液移至Gimsa染液孔用Gimsa室溫染色30 min，PBS液輕洗數次。小鑷完整取聚碳酸酯膜后晾干使膜底面朝上，載玻片中性樹膠封片。在光學顯微鏡高倍鏡下(×40物鏡)觀察并隨機取6個視野計數，取平均值并統計結果。

2 結 果

2.1乳腺癌細胞Heparanase、HYAL1、CD44v6的蛋白表達 蛋白印跡結果數據統計如圖1、圖2所示：各藥物處理組Heparanase、HYAL1、CD44v6的蛋白表達水平較對照組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。凝膠圖掃描如圖3顯示，UTI劑量與目標蛋白表達呈量效關系，UTI與TXT聯合用藥作用則更加顯著(P<0.05)。

圖1 Heparanase、HYAL1、CD44v6蛋白在MCF-7細胞中的表達水平

圖2 Heparanse、HYAL1、CD44v6蛋白在MDA-MB-231細胞中的表達水平

2.2乳腺癌細胞的侵襲能力 如圖4所示，兩種細胞藥物處理24 h后侵襲能力顯著降低，與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；加藥組UTI中和UTI高組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，其余各組兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，可以看出UTI對細胞侵襲抑制效果顯著且UTI與TXT聯合用藥效果更佳(其中MCF-7細胞對照組侵襲OD均值為1.059；聯合用藥后為0.393；MDA-MB-231對照組為1.107，聯合用藥后為0.469)。

2.3乳腺癌細胞的遷移能力 乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231兩系細胞分別處理24 h后遷移情況如圖5所示(遷移程度采用細胞計數方法統計)：UTI藥物干預后兩種乳腺癌細胞遷移能力顯著下降，加藥組與空白對照組細胞遷移數目差異有統計學意義(P<0.05)；加藥組UTI中和UTI高組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，其余各組兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，UTI對細胞遷移抑制作用顯著且UTI與TXT聯合用藥效果更加顯著(其中MCF-7細胞對照組遷移平均數152個，聯合用藥后遷移為86個；MDA-MB-231對照組156個，聯合用藥后為93個)。

1:TXT+UTI;2:UTI高;3:UTI中;4:UTI低;5:空白對照組。

圖4 乳腺癌細胞侵襲能力(OD570)

圖5 乳腺癌細胞遷移能力(OD570)

3 討 論

細胞發生侵襲和轉移首先必須破壞細胞外基質(ECM)和基底膜(BM)構成的屏障，其主要成分為結構蛋白和糖胺聚糖。近期研究發現乙酰肝素酶是哺乳動物體內惟一能降解細胞外基質中硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)側鏈-硫酸乙酰肝素(HS)的內切糖苷酶，其酶活性啟動后有幾方面作用：首先，Hpse降解HS，破壞ECM和BM屏障,促進腫瘤細胞侵襲轉移；其次，HSPG中大量儲存的肝素結合型生長因子(VEGF、bFGF等)被釋放，從而促進乳腺癌的血管生成，促進轉移；再次，HSPG裂解產物抑制活化的T淋巴細胞使機體免疫功能降低；同時，尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)和組織型纖溶酶原激活物(t-PA)被激活,激活纖溶酶后進而激活基質金屬蛋白酶9(MMP-9)[4]。相關研究證明活化的MMP-9、u-PA等可以通過Ras-Raf-MEK-ERK信號通路激活細胞外信號調節激酶，使之磷酸化進而調控腫瘤細胞內基因表達、促進細胞生長，本課題組前期研究發現UTI可使MMP-9、u-PA等表達降低[2，5]。還有研究發現Hpse可以獨立于酶活性之外發揮生物學功能，如：Hpse通過細胞表面相應受體蛋白結合后促使AKT、表皮生長因子受體(EGFR)的磷酸化作用，從而激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K/Akt) 信號轉導途徑,激活內皮細胞，促進腫瘤細胞的生長和侵襲轉移過程[4-7]。Zhang等[8]利用siRNA干擾沉默體外乳腺癌細胞Hpse基因的表達后發現癌細胞的侵襲、黏附能力顯著降低，異體移植裸鼠模型實驗也發現Hpse沉默表達顯著降低了癌細胞的侵襲、轉移能力。本實驗發現UTI干預乳腺癌細胞后Hpse表達下降，細胞的侵襲、轉移能力亦降低，提示可能與UTI抑制了Hpse蛋白表達有關。

透明質酸酶(HAase)和透明質酸(HA)是大部分哺乳類動物組織ECM的主要成分，HAase的分型HYAL1在人類乳腺癌細胞過度表達，Tan等[9]發現通過質粒轉染細胞后劃痕試驗及ELISA實驗證明HYAL1在體外乳腺癌的表達上調可以促進癌細胞侵襲和血管形成，同時HYAL1高表達可以促進裸鼠乳腺異種移植腫瘤的生長和轉移。HYAL1可以特異水解HA，將HA分解成多個寡聚糖，相關文獻分析相對分子質量較大的寡聚糖通過幾種方式促進腫瘤的侵襲和轉移：(1)通過MAPK通路刺激細胞的生長；(2)破壞膠原纖維和糖蛋白的網狀結構平衡使組織變形促進細胞黏附、遷移；(3)HA與其受體CD44結合使酪氨酸激酶磷酸化產生細胞信號傳導進而使細胞骨架變化增強腫瘤細胞的運動能力；小分子的寡聚糖則可以促進新生血管的形成從而為腫瘤的發展提供條件[10-11]。本實驗發現UTI使乳癌細胞HYAL1表達顯著降低，實驗細胞侵襲、轉移能力的降低可能和UTI抑制了HYAL1的表達有關。

CD44是一種細胞黏附分子，也是一種細胞表面跨膜糖蛋白，負責細胞之間及細胞與間質的連接。CD44v6是其中一種變異型，有研究表明CD44v6在腫瘤細胞中表達豐富并與乳腺癌細胞的侵襲和轉移有關[12]。AKT是一種絲氨酸蛋白激酶，活化的AKT是促進細胞增殖轉移和抑制凋亡的PI3K/AKT信號通路的關鍵酶，透明質酸與CD44v6結合后促進AKT的磷酸化在癌細胞的生長轉移過程中作用顯著，近期研究表明CD44v6高表達和AKT磷酸化密切相關[13-15]。本實驗發現UTI可以顯著抑制CD44v6蛋白的表達。

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