前列腺素E2對結(jié)腸癌細(xì)胞CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位的影響*

謝福利，翟惠虹

(1.寧夏師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院，銀川 756000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科，銀川 750004)

20世紀(jì)70年代研究發(fā)現(xiàn)大腸癌患者體內(nèi)前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)含量是其它腫瘤的1.7～5.0倍[1]。80年代應(yīng)用非甾體消炎藥可降低結(jié)腸癌40%～50%發(fā)病率[2]。PGE2異常升高與腫瘤的關(guān)系密切，促進(jìn)結(jié)腸癌的進(jìn)展[3]。鈣周期素結(jié)合蛋白(calcyclin-binding-protein，or siah-1 interacting protein,CacyBP/SIP)自1996年發(fā)現(xiàn)以來，越來越多的證據(jù)顯示[4-5]：CacyBP/SIP在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面都有重要的作用；同時，CacyBP/SIP具有依賴Ca2+濃度的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象[6]。PGE2是否可誘導(dǎo)CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位，由此促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖？本研究擬通過構(gòu)建CacyBP/SIP過表達(dá)慢病毒顆粒，轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞，給予PGE2刺激，觀察CacyBP/SIP在結(jié)腸癌細(xì)胞中的定位，明確PGE2是否誘導(dǎo)CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位。

1 材料與方法

1.1材料 結(jié)腸癌細(xì)胞SW480購于上海中科院。小牛血清、L15培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco公司；CacyBP/SIP mAb購于Cell signaling；PGE2購于Cayman公司；胞漿胞核蛋白抽提試劑盒購于pierce公司；DAPI染色劑購于Sigma公司； FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為中山公司產(chǎn)品；Triton x-100裂解液試劑盒為北京鼎國公司；293T細(xì)胞、pGC-LV重組載體、pHelper 1.0、pHelper 2.0來源于吉凱基因公司；PVDF膜購自Merck公司；其他相關(guān)試劑購自Takara、Fermentas、SinoBio、NEB、捷瑞公司。

1.2方法

1.2.1過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建 應(yīng)用人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116的cDNA序列，采用Primer Premier v5.0軟件設(shè)計(jì)上游和下游引物，PCR法擴(kuò)增，分別用Nhe I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，T4 連接酶將酶切后的產(chǎn)物相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR法篩選陽性克隆，接種陽性轉(zhuǎn)化子，送測序。慢病毒包裝、采用逐孔稀釋法測定并標(biāo)定病毒滴度。

1.2.2轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞 用含10%的56 ℃、30 min熱滅活小牛血清的L15培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞長至80%～90%傳代。至細(xì)胞在T50瓶長至30%～50%時，每瓶加入500 μL(5 μg/mL)Polybrene、4 400 μL完全培養(yǎng)基和100 μL(1×108)過表達(dá)CacyBP/SIP的慢病毒顆粒，在水平方向輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使其充分混勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～12 h以后觀察細(xì)胞狀態(tài)，更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3激光共聚焦和Western blot檢測 正常消化傳代并行激光共聚焦檢測。再取3個12孔培養(yǎng)板，每孔放置一個細(xì)胞爬片，每孔接種(3～4)×104細(xì)胞于12孔板。至細(xì)胞長至最佳狀態(tài)時，吸干培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次，每個培養(yǎng)板加入2 mL含100 μmol/L PGE2培養(yǎng)基，對照組每孔分別加入完全培養(yǎng)基作為對照。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。固定、打孔、用含DAPI封片劑染色封片。激光共聚焦檢測CacyBP/SIP在細(xì)胞中的定位。Western blot法檢測：分別取轉(zhuǎn)染后的SW480細(xì)胞，在給予100 μmol/L PGE2刺激前、后1 h，分別抽提胞漿、胞核蛋白，用BCA定量；上樣緩沖液稀釋至5 μg/uL、煮沸后-80 ℃凍存；把20 μL蛋白樣品上樣到12%SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，電泳電壓80 V，時間20 min；濕式轉(zhuǎn)膜，電流200 mA，60 min；加入5%脫脂牛奶封閉60 min后，加入CacyBP/SIP單抗(1∶200)4 ℃孵育過夜，常規(guī)洗膜后加入羊抗鼠IgG(1∶2 000)的二抗，室溫孵育1 h，洗滌。曝光、顯影。

2 結(jié) 果

2.1激光共聚焦檢測PGE2刺激前、后CacyBP/SIP 在細(xì)胞內(nèi)定位和表達(dá) 無PGE2刺激條件下 CacyBP/SIP 主要位于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，給予100 μmol/L PGE2刺激1 h條件下CacyBP/SIP可轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)(圖1)；100 μmol/L PGE2刺激0.5 h條件下CacyBP/SIP無明顯核轉(zhuǎn)位(圖2)。

a：白光下細(xì)胞；b：未給予PGE2刺激CacyBP/SIP位于胞漿；c：DAPI染色；d：重疊圖像顯示CacyBP/SIP位于胞漿；e：白光下細(xì)胞；f：給予PGE2刺激 CacyBP/SIP進(jìn)入胞核；g：DAPI染色；h：重疊顯示CacyBP/SIP位于胞核。

a：白光下細(xì)胞；b：CacyBP/SIP；c：DAPI染色；d：重疊圖像顯示。

-:表示無刺激;+:有刺激;C:胞漿;N:胞核。

2.2Western blot檢測PGE2刺激前、后CacyBP/SIP在細(xì)胞內(nèi)定位和表達(dá) 無刺激條件下，CacyBP/SIP主要在胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，給予100 μmol/L PGE2刺激1 h，可在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)(圖3)。

3 討 論

1996年Filipek從小鼠腹水瘤細(xì)胞和鼠腦組織中首次發(fā)現(xiàn)一個以依賴Ca2+濃度，可與S100 A6結(jié)合，命名為 Calcyclin(S100A6)-binding-protein(鈣周期素結(jié)合蛋白)，既CacyBP。2001年在研究p53刺激下β-catenin泛素化降解新通路時，從cDNA文庫中調(diào)到一個可以與Siah-1相互作用的蛋白，命名為 Siah-1-interacting-protein，即SIP。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SIP即CacyBP，因此，目前命名為CacyBP/SIP。其相對分子質(zhì)量約26×103，含一個687 bp的開放閱讀框，編碼228個氨基酸，存在7個磷酸化位點(diǎn)和1個核定位信號[7]。

目前，對CacyBP/SIP功能研究較少，其功能主要表現(xiàn)在：(1)與p53有關(guān)：參與了新的泛素-蛋白酶體降解，當(dāng)p53在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)升高時，可誘導(dǎo)Siah-1基因的表達(dá)，共同組成泛素連接酶復(fù)合體(Siah-1-CacyBP/SIP-SCF)，將未被磷酸化的β-catenin蛋白酶體降解；(2)與紅細(xì)胞有關(guān)[8]：有報(bào)道促紅細(xì)胞生成素受體活化可促進(jìn)CacyBP/SIP表達(dá)上調(diào)。

以往研究發(fā)現(xiàn)， CacyBP/SIP在胃癌阿霉素耐藥細(xì)胞中高表達(dá)[9]并參與胃癌細(xì)胞多重耐藥,其下調(diào)可以部分逆轉(zhuǎn)耐藥性[10]。在腎細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)：CacyBP/SIP表達(dá)上調(diào)能抑制腎細(xì)胞癌的增殖和腫瘤形成[11]。近年來又發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP參與乳腺癌、胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，可能成為預(yù)后不良的生物學(xué)指標(biāo)之一[12-14]。因此，推斷CacyBP/SIP與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本課題組前期利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備了3株CacyBP/SIP單克隆抗體，對正常及腫瘤組織中CacyBP/SIP表達(dá)分布狀況做了較系統(tǒng)的研究，研究發(fā)現(xiàn)[15-16]：CacyBP/SIP在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，在正常結(jié)腸組織不表達(dá)，且主要定位于胞漿及胞核；給予給KCl刺激后，通過升高胞漿內(nèi)Ca2+濃度，可誘導(dǎo)CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位。

2002年Filipek等[6]首次發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP具有依賴Ca2+濃度的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，那么，究竟哪些因素可以引起CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位？

PGE2在生理狀態(tài)下含量很低，卻又具有很強(qiáng)的生理活性。環(huán)氧酶-2(COX-2)是 PGE2合成的限速酶，應(yīng)用非甾體消炎藥降低結(jié)腸癌發(fā)病率主要是通過抑制COX-2活性達(dá)到治療作用，選擇性COX-2抑制劑成為結(jié)腸癌防治的一條新途徑。PGE2異常升高與腫瘤的關(guān)系密切：直腸癌PGE2含量與肝肺轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；大腸癌PGE2含量和腫瘤大小呈正相關(guān)，并且Dukes′D期明顯高于B、C期；PGE2能顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長；PGE2含量與腫瘤分化程度呈正相關(guān)；結(jié)腸癌化療中用其抑制劑提高了患者生存率[18]。

本研究通過CacyBP/SIP過表達(dá)慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP主要位于細(xì)胞胞漿，Western blot亦證實(shí)其位于胞漿。給予PGE2刺激發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP可發(fā)生核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，Western blot亦證實(shí)CacyBP/SIP在刺激前位于胞漿，刺激后位于胞核。蛋白在細(xì)胞中的定位常常與其功能密切相關(guān)， CacyBP/SIP在給予刺激后發(fā)生核轉(zhuǎn)位及磷酸化，提示其可能做為信號分子傳遞信息，從而參與細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。作者前期已發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP在結(jié)腸癌中高表達(dá)，免疫組化結(jié)果提示CacyBP/SIP位于胞漿及胞核，PGE2可誘導(dǎo)CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位，CacyBP/SIP是否作為信使，傳遞上游促進(jìn)惡性腫瘤增殖的信號，需進(jìn)一步研究。

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