基于形態性狀及Adh1基因序列的芒與五節芒自然雜交現象研究

朱明東，蔣建雄，肖亮，艾辛，覃靜萍，陳智勇，易自力

（湖南農業大學生物科學技術學院 芒屬植物研究所，湖南 長沙410128）

＊芒（Miscanthussinensis）和五節芒（M.floridulus）系禾本科芒屬（Miscanthus）的2個主要種［1］，主要分布于東南亞地區。我國是芒和五節芒的主要分布中心，五節芒在長江中下游以南地區有著廣泛分布，芒的分布范圍更廣，在黃河流域以南地區和東北地區都有分布。由于芒和五節芒均為多年生C4草本植物，具有生物質產量高、纖維素含量高、高熱值、灰分含量低、適應性強、生長繁殖快等特點，近年來已被視為極具開發潛力的能源植物而受到高度關注。

作為新型的能源植物資源，芒和五節芒遺傳背景與親緣關系的探討自然是重要的研究內容。筆者在進行我國芒屬植物資源調查與遺傳多樣性分析中，按照經典的形態學分類依據［2］，發現在芒和五節芒的部分重疊分布區有許多表型性狀介于兩者之間的中間類型存在，主要表現為其圓錐花序類似于芒，但小穗的形態則類似于五節芒，同時開花期介于2個種之間，疑似為芒與五節芒的自然雜交產物。研究自然雜交滲透主要有3個途徑，表型分析［3－5］，細胞生物學研究［6］和來自分子生物學［7－14］的證明。本研究即采用基于形態學標記和Adh1基因序列標記的系統發育分析來證實這種種間自然雜交現象的存在與否。如果芒和五節芒存在自然雜交這一現象得到證實，不僅可以填補這一研究領域的空白，為闡明芒屬植物復雜的系統發育與進化關系提供理論基礎，而且還能為芒與五節芒作為能源植物應用所需的遺傳改良提供雜交育種的依據。為了闡明這一問題，筆者進行了2個方面的研究：一是建立保存活體材料的資源圃，將不同生態來源的樣本種植在同樣的生態環境下，進行多年份的形態學性狀考察分析，以排除環境飾變的影響；二是通過Adh1（乙醇脫氫酶）基因的序列分析來鑒定是否有種間雜種的存在，因為Adh1基因具有豐富的多態性，已被廣泛應用于研究植物的遺傳進化和親緣關系，是揭示近緣種群間遺傳背景的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與來源

本試驗所用植物材料的分類名及其來源地見表1。具有中間性狀的疑似雜交種采自福建南平市芒與五節芒混生的地區。在本研究中用作外參照的芒（AD512）和五節芒（AA335）來源于湖南瀏陽地區2個獨立的種群。取材料的根莖，種植于湖南農業大學芒屬植物資源圃。該資源圃位于湖南省長沙市東郊，北緯28°11′，東經113°02′，海撥80m，土壤為紅壤土，肥力中等，屬亞熱帶季風濕潤氣候區。栽培方式為每4m3種植1株，按常規方法進行一致的栽培管理。

表1 供試材料Table 1 Plant materials for this study

1.2 表型性狀分析

1.2.1 性狀測定 連續3年（2008，2009，2010）對供試材料的以下17個性狀進行了測定，17項性狀包括旗葉長（flag leaf length，FLL）、旗葉寬（flag leaf width，FLW）、最大葉片長（largest leaf length，LLL）、最大葉片寬（largest leaf width，LLW）、每個分蘗葉片數（leaf number per tiller，LNT）、株高（plant height，PH）、莖長（stem height，SH）、每分蘗莖節數（internode number per tiller，INT）、花序長（panicle length，PL）、主軸長（panicle main axis length，PMAL）、主軸長／花序長（panicle main／panicle length，PMAL／PL）、芒長（awn length，AL）、基盤毛長（callus hair length，CHL）、小穗長柄長（long stalk length，LSL）、小穗短柄長（short stalk length，SSL）、種子長（grain length，GL）、種子寬（grain width，GW）。葉片、莖稈及花序性狀考察時，取生長正常、無病變植株測量，取5次重復平均數；小花性狀和種子性狀考察時，分別取無病變小花20朵和種子20枚計平均數。

1.2.2 性狀聚類 形態性狀測定結果采用ZScores進行標準化轉換，計算13個材料的歐氏距離，在MVSP 3.2軟件上采用 Gower general similarity coefficient模型用 UPGMA 法聚類。

1.3 Adh1基因序列分析

1.3.1 DNA提取與擴增 基因組DNA采用改良的CTAB法進行提取。基因片段的擴增使用引物Adh1F－（5′－ATAGAGAGTGTTGGAGAGG－3′），Adh1R－（5′－GTTCTCCATGCGGATGATGC－3′）在 Biometro PCR儀器上進行。擴增用TaqDNA聚合酶來自東盛生物公司，擴增條件為：94℃預變性5min；94℃1min，56℃1 min，72℃1.5min，34次循環；72℃延伸7min。擴增體系為：Primer mix 4μL，DNA 2μL，Plus mix 25μL，ddH2O補齊至50μL。

1.3.2 回收體系 PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠在TAE電泳檢測并回收目標片段。產物回收使用OMEGA公司生產的PCR產物回收試劑盒（E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit）。純化后的產物用PGT57R／T質粒（Fer－mentas，InsTAcloneTM PCR Cloning Kit）鏈接，之后轉化大腸桿菌Top10，在含氨芐青霉素和5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D半乳糖苷（X－gal）的LB固體培養基上進行藍白斑篩選陽性克隆。樣品送上海生工測序，測序引物使用M13R／F通用引物。

1.3.3 序列分析 序列的對齊使用ClustalX1.81［15］程序，對齊后的序列加以人工檢查。基因樹的構建采用MEGA4.0［16］程序。最大簡約樹（maximum parsimony，MP）的構建采用啟發式搜索，樹2等份再連接分支交換（TBR），自展檢測（bootstrap analysis）重復500次。鄰接樹（neighbor－joining，NJ）的構建使用 Kimura兩參數模型（kimura 2－parameter），自展檢驗（bootstrap analysis）重復1 000次。本研究中構建分子進化樹所用的Adh1基因序列，除了來源于表1中所列的芒與五節芒材料之外，還從GeneBank中選用了2個五節芒（AJ515961和AJ515962）和3個芒（AJ515964、AJ515985和AJ515973）的Adh1基因序列進行分析。同時選用了玉米（Zea mays）（ZL08591和 MX04049）、高粱（Sorghumamplum，Sorghumleiocladum）（DQ096179和DQ096187）、狼尾草（Pennisetumglaucum）（L20576和L20582）作為構建系統樹的外類群。

2 結果與分析

2.1 形態學聚類分析

本研究對13份供試材料的17個表型性狀進行連續3年測定，測量均值見表2。在形態性狀聚類分析中，利用 MVSP 3.2軟件采用Gower general similarity coefficient模型進行 UPGMA聚類分析，形態性狀聚類結果見圖1。形態學性狀的聚類結果顯示，芒和五節芒在聚類圖中可以被完全區分開。而6份疑似雜交種則沒有能夠單獨聚為一類，其中疑似雜交種AD431與五節芒類群（AA335和AD625）聚為一大類，而疑似雜交種AA343、AD628、AD607、AD633和AD606與芒類群（AD623、AD512、AD620、AD619和AD627）聚為另一大類（圖1）。這表明形態性狀聚類分析不能鑒定出雜交種的真實性。

2.2 Adh1基因序列特征及聚類分析

2.2.1 基因序列的特征 分別從13份供試材料擴增出的目的片段大小均為1 400bp左右，經測序后得到堿基序列，將所測序列在GeneBank中比對證實均為Adh1基因，經整理上傳至GeneBank后獲得序列號（表1）。

表2 17項表型性狀統計結果Table 2 17morphological characters

圖1 基于17個表型性狀標記的聚類圖Fig.1 Cluster analysis based on 17morphological traits

在Softberry上運用FGENESH進行序列分析，結果表明芒屬植物的Adh1基因包括6個外顯子和5個內含子，外顯子片段大小為60～210bp，平均大小為114bp；在13份材料用來構樹的19個序列中，序列大小為1 413～1 444bp，平均大小為1 430bp，A，T，C，G堿基含量分別為24.7%，30.3%，20.5%，24.5%，序列有明顯的T堿基偏好，AT堿基含量（55.0%）明顯大于CG堿基含量（45%）。當用ClustalX對齊20個序列并排除空位和多重迭代后顯示序列長度為1 473bp。顛換值為16，轉換值為27，轉換（SV）明顯大于顛換（SI），轉換與顛換的比為1.7。

2.2.2 聚類分析 序列采用ClustalX1.81程序排除空位并對齊，用MEGA4.0程序構建Adh1基因序列的最大簡約樹（MP）和鄰接樹（NJ），結果如圖2和3所示，分支上的數值顯示其自展支持率。

最大簡約樹和鄰接樹具有基本一致的拓撲結構，芒屬作為單系類群能夠很好地與狼尾草、玉米和高粱等外類群區分開。在芒屬分支中，芒和五節芒的材料被分別聚成可明顯區分的2類。而在每一個疑似雜交種中，均檢測到有2種Adh1基因單倍型的存在，其中一個為芒的單倍型，在系統樹中與其他芒的Adh1基因聚為一類；另一個為五節芒的單倍型，在系統樹中則與其他五節芒的Adh1基因聚為一類。基于Adh1基因序列的系統發育分析表明，這些疑似雜交種確實為芒與五節芒自然雜交的產物。

3 討論

本研究驗證了疑似雜交種的真實性，證實了芒與五節芒的種間自然雜交現象的存在。這2個物種之所以能夠產生自然雜交，可能的原因主要有如下幾個方面：一是芒和五節芒親緣關系很近，為近緣種，具有相近的遺傳基礎，二倍體的染色體數目均為2n＝2x＝38；二是兩者的地理分布上有重疊，在野外種質資源調查中發現，在有五節芒分布的地區，幾乎也都有芒的分布，在部分地區兩者甚至混生在一起；三是芒和五節芒均為較嚴格的自交不親和植物，有性生殖以異花授粉為主。據中國植物志記載，芒的開花期通常是8－10月，而五節芒的開花期為5－6月，兩者開花期相差較大。但在研究中發現五節芒的生殖分蘗中下部的節位有時候會發生第2次抽穗開花的現象，花期剛好與芒的花期相重疊，為兩者發生自然雜交提供了花期相遇的可能。為了進一步證實芒與五節芒的種間雜交現象，湖南農業大學芒屬植物研究所開展了人工雜交試驗，并成功獲得了真實的雜交種，說明芒與五節芒之間確實具有發生種間雜交的遺傳基礎。芒屬植物不同的種群間存在的這種自然雜交現象，會使得芒屬植物種群內和種群間的遺傳與進化關系變得更為復雜，這無疑給其經典分類學和系統學研究增加了難度。因此長期以來，基于形態學鑒定的有關芒屬的分類及其親緣關系研究一直都存在著爭議，屬下等級的劃分也有不同的歸并與拆分結果［1，2］。

圖2 基于Adh1基因序列的最大簡約樹Fig.2 Maximum parsimony（MP）of Adh1gene sequence

圖3 基于Adh1基因序列的鄰接樹Fig.3 Neighbor－joining（NJ）of Adh1gene sequence

本研究發現，采用基于形態學性狀的聚類分析并不能有效的將雜交種區分開來，而采用Adh1基因序列聚類分析則成功將雜交種鑒定出來。導致這2種聚類分析方法出現差異的本質原因在于：自然雜交所產生的雜交種，往往會與親本再發生回交，出現所謂的漸滲雜交（introgressive hybridization）現象［17］，從而導致1個種群的基因逐漸滲入到了另1個種群的基因庫中。這種種群間的基因滲透，豐富了種群內的遺傳背景，增大了種群內的遺傳差異性和表型多樣性，為自然選擇提供了新的遺傳資源，促進了物種的進化。但與此同時，種間的這種基因滲透，則降低了種群間的遺傳差異性，使得種群間的遺傳背景和表型性狀趨于同化，從而導致這2個種群在進化上表現出趨近的親緣關系。但漸滲雜交所帶來的遺傳物質的改變，在DNA分子水平上都能體現出來，通過基因序列的測定也都能夠直接鑒定出來，包括內含子和外顯子序列所發生的變化。從本研究的測序結果可以發現，雜交種Adh1基因的內含子和外顯子堿基序列均發生了改變，外顯子堿基序列的變異更為豐富；而能夠反映到形態上出現差別性狀，僅僅只是那些由外顯子上的顯性基因所控制的少數性狀，大量的中性突變在形態學上是沒有反映的。因此，基因序列聚類分析與形態性狀聚類分析的結果出現差異是常見的，而基因序列聚類分析結果所反映出的物種變化更本質、更全面、更準確，用它所鑒定出的雜交種也更可靠。

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