草坪禾草根腐病病原菌生物學特性研究

古麗君，徐秉良＊，李彬，梁巧蘭

（1.甘肅農業大學草業學院 草業生態系統教育部重點實驗室 甘肅省草業工程實驗室 中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州730070；2.甘肅農業大學農學院，甘肅 蘭州730070）

＊隨著我國草坪業的發展，綠地面積的擴大及草坪集約化管理程度的提高，病害逐漸成為影響草坪質量、降低草坪利用年限的主要限制因素之一，致使草坪提早衰敗、難以利用，甚至廢棄。草坪禾草根腐病（Pythiumdiseases）是一種破壞力極強的病害，草坪禾草根腐病引起根、莖和心葉腐爛，發病條件適宜時，能在一夜之間毀壞大面積草坪，對景觀效果破壞極為嚴重。它既能在冷濕生境中侵染危害，也能在天氣炎熱時猖獗流行，從坪草中分離出多種腐霉菌［1］，其中引起草坪禾草根腐病之一的瓜果腐霉（Pythiumaphanidermatum）具有很強的致病力和廣泛的寄主范圍。

國內外有關草坪禾草根腐病病原的鑒定以及病害藥劑防治等方面已有報道。Abad等［2］報道大約有33種腐霉菌可以侵染多年生黑麥草（Loliumperenne）和匍匐剪股穎（Agrostisstolonifera），其中瓜果腐霉、終極腐霉（Pythiumultimum）在30～35℃時有很強的致病性。石潔等［3］對保定市冷季型草坪草根腐病發生情況進行調查，結果表明，保定市草坪根腐病的主要病原菌為鐮刀菌（Fusarium）、腐霉菌（Fythium）及離孺孢菌（Bipolaris sorokiniana），其中腐霉菌的分離頻率為19.2%；張玉琴等［1］認為腐霉菌的寄主范圍非常廣泛，所有的冷季型草坪草和暖季型草坪草狗牙根（Cynodondactylon）容易被瓜果腐霉侵染；穆合塔爾等［4］研究發現，草地早熟禾（Poa pretensis）、紫羊茅（Festucarubra）、高羊茅（Festucaarundinacea）和多年生黑麥草對腐霉枯萎病感性有差異，它們分別代表極感、高感、中感和低感類型，并根據試驗結果模擬出在草坪上防治腐霉枯萎病的農藥及適宜用藥量。李崴等［5］研究認為，天津地區腐霉枯萎病的致病菌主要為瓜果腐霉菌。腐霉屬種間的差異性導致草坪草不同器官受侵染的程度不同，所采取的防治措施也不盡相同。張金林等［6，7］從多年生黑麥草上分離得到的瓜果腐霉毒素對多年生黑麥草具有很強的破壞作用。楊亞君等［8］就瓜果腐霉毒素對多年生黑麥草的抗病性進行了研究，發現多年生黑麥草對毒素敏感。徐嬌等［9］通過對光合系統Ⅱ、丙二醛、超氧自由基、希爾反應活力、根系活力以及葉片含水量等指標的測定，明確了瓜果腐霉毒素對多年生黑麥草的致病機理。古麗君等［10］研究發現，深綠木霉（Trichodermaaureoviride）對引起禾草腐霉病原菌瓜果腐霉有明顯的抑制作用，主要作用機制為重寄生作用。

目前，有關草坪禾草根腐病病原生物學特性方面的系統資料相對較少［11］。余永年和馬國忠［12］報道了溫度對中國腐霉屬菌絲生長的影響，并討論它在分類學和親緣關系上的意義。徐嬌等［13］只研究了瓜果腐霉PA1菌株在不同溫度下的生長速率。孫淑琴等［14］通過連續3年對天津地區草坪腐霉枯萎病病害發生調查，總結出病害發生規律：高溫高濕的氣候條件是腐霉枯萎病發生的主要因素，通過病原菌致病性測定，篩選強致病性菌株，鑒定其為瓜果腐霉，并進行了溫度、pH值、碳氮源對菌落生長速率影響的研究。研究該病原菌的生物學特性對了解其所致病害的發生規律和制定有效的防治措施具有重要的意義。因此本試驗對瓜果腐霉菌的生物學特性進行了深入詳細的研究。

1 材料與方法

1.1 材料來源

從蘭州市發病嚴重的混播草坪禾草中采集新鮮的草坪禾草根腐病病株，進行組織分離培養，經病原菌形態、培養性狀和致病性等方面的研究，確定主要致病菌為腐霉屬的瓜果腐霉［15］。2009年9月在甘肅農業大學草業學院植物病原學實驗室對已鑒定的病原菌進行生物學特性試驗。

1.2 生物學特性試驗

1.2.1 溫度對菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響 取培養4d的菌落，用無菌打孔器（d＝0.5cm）沿菌落邊緣打取菌塊移入PDA平板中央，每皿1塊，分別置于5，10，15，20，25，30，35，40，45℃條件下無光照保濕培養12 h，十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落平均生長速度［16］。每個處理5次重復。20d后挑取老熟菌絲涂片，并于10×鏡下隨機記數一個視野內的孢子囊、卵孢子產量，每個重復隨機記數5個視野。

1.2.2 光照對菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響 將已接種的PDA培養皿分為5組，作如下處理：1）25℃持續光照培養24h（光照培養箱）；2）25℃持續黑暗培養24h；3）25℃黑暗12h與光照12h交替培養24h；4）紫外線照射2h后于25℃連續黑暗培養24h；5）紫外線照射2h后于25℃持續光照培養24h，測量菌落直徑，計算菌落平均生長速度。20d后測孢子囊、卵孢子產量。每處理重復5次。

1.2.3 pH值對菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響 用0.1mo1／L的NaOH或HCl將滅過菌的PDA培養基調節pH 為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0七個梯度，將菌塊接在不同pH 的PDA平板中央，25℃下培養24 h，測量菌落直徑，計算菌落平均生長速度。20d后測孢子囊、卵孢子產量。每個處理5次重復。

1.2.4 碳源對菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響 試驗所用的基本培養基每升蒸餾水中含1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.01g FeSO4·7H2O、30g蔗糖、0.5g KCl、2g NaNO3，制平板時每升培養液中加入17 g瓊脂。分別以相同質量的葡萄糖、麥芽糖、淀粉、D－木糖和山梨醇代替基本培養基中的蔗糖，配成不同碳源的培養基，并以不加碳素的培養基為對照。沿菌落邊緣取直徑為0.5cm菌塊接入平板中央，25℃恒溫培養箱中培養，12h后觀察菌體形態情況，并測量菌落直徑。20d后測孢子囊、卵孢子產量。每個處理重復5次。

1.2.5 氮源對菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響 分別以相同質量的硝酸鉀、硝酸銨、氯化銨、脲替代上述基本培養基中的NaNO3，配成不同氮源的培養基，并以不加氮素、補加2g 0.1mol／L NaCl的培養基為對照。將菌塊接在不同氮源的平板中央，25℃恒溫培養箱中培養24h，測量菌落直徑，計算菌落平均生長速度。20d后測孢子囊、卵孢子產量。每個處理5次重復。

1.2.6 不同的培養基對菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響 供試培養基為PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養基）、CMA（玉米粉瓊膠培養基）、CAA（胡蘿卜瓊膠培養基）、OA（燕麥片瓊膠培養基）、TCA（番茄瓊膠培養基）。接菌后置于25℃培養箱培養，24h后測量菌落直徑。20d后測孢子囊、卵孢子產量。每個處理重復5次。

PDA［17］：馬鈴薯200g，葡萄糖10～20g，瓊膠17～20g，水1 000mL，將洗凈后去皮的馬鈴薯切碎，加水1 000mL煮沸30min，用紗布濾去馬鈴薯，加水補足1 000mL。然后加糖和瓊膠，加熱使瓊膠完全溶化后，分裝滅菌（121℃，20min）。

CMA［18］：玉米粉300g，瓊膠17g，水1 000mL，玉米粉加水1 000mL，在沸水浴上加熱1h，紗布過濾后加水補足1 000mL，加瓊膠溶化后分裝滅菌（121℃，20min）。

CAA［19］：新鮮胡蘿卜200g，瓊膠20g，水1 000mL，將新鮮胡蘿卜切成小片，加去離子水500mL，用組織搗碎機搗碎約40s，雙層紗布過濾去渣，加水補足1 000mL，加入瓊膠溶化后分裝滅菌（121℃，20min）。

OA［19］：燕麥片30g，瓊膠17～20g，水1 000mL，配制的方法與玉米粉瓊膠培養基相同。

TCA［19］：番茄汁300g，瓊膠20g，CaCO30.4g，水80mL，番茄果實用水洗凈切片，榨汁2min，雙層紗布過濾，濾液即為所制備的番茄汁，加入瓊膠溶化后分裝滅菌（121℃，20min）。20d后測產孢量。

2 結果與分析

2.1 溫度對病原菌菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響

瓜果腐霉菌對溫度的適應范圍較寬，菌絲在15～40℃內均可生長，不同溫度條件下，菌落擴展速度不同，最適宜溫度為30～35℃，低于10℃或高于45℃時菌落停止生長（圖1）。溫度在15～40℃均可產生孢子囊，但是在30～35℃時孢子囊產量相對較低，即在菌落生長最適溫度下孢子囊的產量最低，在菌落生長不利的溫度下孢子囊的產量較高；卵孢子在20～25℃時的產量最大，低于10℃或高于30℃時不產生卵孢子，卵孢子的產生條件較為嚴格。

圖1 溫度對菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響Fig.1 Effect of temperature on the hyphae growth，sporangium and oospore quantity

2.2 光照對病原菌菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響

處理2、處理5為全黑暗條件培養，菌落生長速度分別為6.46和6.58cm／d（圖2），黑暗條件有利于菌落的擴展，紫外光處理2h后的菌落生長速度最快，說明紫外光照射可以促進菌絲的生長，全光照條件下培養的菌落生長速度最慢；光照對孢子囊、卵孢子的產量影響很大，紫外燈處理2h后全光照條件培養的孢子囊產量遠遠大于其他培養條件，紫外光處理可以大大提高孢子囊的產量；黑暗條件有利于卵孢子的產生，全黑暗條件下卵孢子的產量達到12個／10倍視野，紫外光照射會抑制卵孢子的產生。

圖2 光照對菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響Fig.2 Effect of light on the hyphae growth，sporangium and oospore quantity

2.3 pH值對病原菌菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響

瓜果腐霉菌對酸堿度適應范圍很廣，在pH值4～10內均可生長，最適于菌落擴展的pH值為7～8，其長勢繁茂，日生長量可達到4.30～4.45cm。堿性條件有利于孢子囊的產生，pH為9時孢子囊產量達到峰值；酸性條件有利于卵孢子的產生，pH為6時卵孢子的產量顯著高于其他pH值時，堿性條件卵孢子產量較低，當pH為10時，不產生卵孢子（圖3）。

2.4 碳、氮源對病原菌菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響

瓜果腐霉能利用多種碳源和氮源，在多種碳源中以蔗糖生長速度最快，山梨醇次之，D－木糖生長最差。方差分析結果顯示，瓜果腐霉菌在蔗糖培養基、山梨醇培養基上的生長速度均顯著高于其他培養基，以蔗糖培養基為最好。以淀粉為碳源則菌絲厚度、孢子囊及卵孢子的產量都最大，試驗結果經SSPS方差分析表明，以淀粉、蔗糖、葡萄糖為碳源時，瓜果腐霉菌孢子囊產量極顯著高于其他培養基（P＜0.01），以淀粉為碳源時，瓜果腐霉菌卵孢子產量極顯著高于其他培養基（P＜0.01）。

瓜果腐霉菌絲對供試的氮源均可利用，方差分析結果顯示，供試菌株在以NH4NO3作為氮源的培養基上生長速度和孢子囊產量均顯著高于其他培養基（P＜0.05），同時菌落厚度也最大，無氮源情況下菌絲厚度很小。以脲為氮源則有利于促進卵孢子的產生（表1）。

圖3 pH對菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響Fig.3 Effect of pH on the hyphae growth，sporangium and oospore quantity

2.5 不同的培養基對病原菌菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響

瓜果腐霉在CAA培養基上生長速度最快，與其他培養基差異極顯著（P＜0.01）；但是在PDA培養基和TCA培養基上菌落厚度最大；在CMA培養基上孢子囊產量最大，與其他培養基差異極顯著（P＜0.01）；在OA培養基上卵孢子產量最大（表1）。

表1 不同碳、氮源及培養基種類對瓜果腐霉菌絲生長及孢子囊、卵孢子產量的影響（25℃）Table 1 Effect of different carbon，nitrogen and various medium on hyphae growth，sporangium and oospore quantity

3 結論與討論

張金林等［20］報道我國坪草病害的種類約30多種，其中由瓜果腐霉菌引起的腐霉枯萎病在北方發生普遍，對多種草坪草造成嚴重的危害。草坪腐霉枯萎病是一種毀滅性病害，病害的發生與多種因素有關［21］。而目前有關瓜果腐霉菌生物學特性方面的系統資料相對較少，因此，進行病原菌的生物學特性試驗有重要的意義。本試驗對病原菌生物學特性的研究結果表明，瓜果腐霉菌在15～40℃均能生長，菌絲生長適宜溫度為30～35℃，這與徐嬌等［13］報道的瓜果腐霉PA1菌株生長的最適溫度相似。這些都與該病在每年6－9月高溫季節迅速發生流行［22］相一致。因此，在高溫氣候來臨之前，一定要作好病害的預防工作。15～20℃時病原菌可以產生的孢子囊最多，同時在40℃時也可以產生較多的孢子囊；20～25℃卵孢子的產量最大。因此，瓜果腐霉通過孢子囊越夏、卵孢子越冬。

通過光照試驗可以得出，黑暗條件有利于病害的蔓延，光照條件病害發生較慢，這也就印證了瓜果腐霉菌在適宜的溫濕度條件下能夠在一夜之間破壞大面積草坪的觀點。卵孢子的產生會受到光照的抑制，但是光照可以大大提高孢子囊產量。瓜果腐霉菌菌絲生長適宜pH值為8，堿性條件（pH＝9）有利于孢子囊的產生，酸性條件（pH＝6）有利于卵孢子的產生，因此，偏堿性土壤上的草坪發病重于酸性土壤，改善土壤酸堿度可以有效預防病害的發生。許多種糖類均可成為該病菌利用的碳源，其中對病原菌菌絲生長有明顯促進作用的碳源是蔗糖，對病原菌菌絲厚度、孢子囊及卵孢子產量有顯著促進作用的碳源是淀粉；在氮源方面，NH4NO3對菌絲生長、孢子囊及卵孢子產量都有明顯的促進作用，同時菌絲生長旺盛。這與真菌數量和氮素正相關［23］理論上相一致。施用過多氮肥既會造成草坪草徒長，又會加劇根腐病的發生，因此，少施氮肥對控制該病害的發生有顯著作用。

草坪禾草根腐病病害的發生除了與溫度、光照、pH等主要因素相關外，還與水肥管理、修剪、種植草坪品種等因素密切相關。在生產上應采取綜合的管理和防治措施，病害發生前后，積極做好預防和防治工作等，將病害發生程度降低到最低水平。具體措施是：合理修剪，使草坪通風透光，搞好草地衛生以減少初侵染源。比較有效的草坪衛生措施是在秋末和冬季或初春對草坪進行焚燒，這樣可以減少下一生長季節的初侵染源。此外，修剪時割下的草葉要及時清理出草坪，攜帶有病蟲害的要及時焚燒或掩埋。培養健壯草坪，均衡適量的增施磷、鉀肥可以提高抗病性。在草坪建植中應選用不同的抗病種或品種混播，以降低草坪病害的發生。根腐病危害嚴重的草坪，要及時進行化學防治。

［1］張玉琴，王代軍，劉榮堂，等.草坪草腐霉枯萎病的研究現狀及進展［J］.草原與草坪，2002，（2）：3－7.

［2］Abad Z G，Shew H D，Lucas L T.Characterization and pathogenicity ofPythiumspecies isolated from trufgrass with symptoms of root and crown rot in North Carolina［J］.Phytopathology，1994，84：913－921.

［3］石潔，李建成，劉玉瑛.草坪草根腐病病原菌研究初報［J］.華北農學報，2000，15（增刊）：94－98.

［4］穆合塔爾，王瑞，劉榮堂.多菌靈防治草坪草腐霉枯萎病的研究［J］.草原與草坪，2000，（2）：22－25.

［5］李崴，李秀文，栗振華，等.天津草坪病害診斷技術研究初報［J］.天津農林科技，2003，（4）：12－14.

［6］張金林.坪草腐霉病菌除草活性毒素組分的分離鑒定與突變菌株的DDRT差異顯示分析［D］.保定：河北農業大學，2005.

［7］張金林，龐民好，劉穎超，等.坪草腐霉病菌毒素產生除草活性物質的條件優化［J］.河北農業大學學報，2005，28（4）：84－88.

［8］楊亞君，陶晡，李川，等.腐霉枯萎病菌毒素在坪草抗病性篩選中的應用研究［J］.草業學報，2008，17（3）：93－98.

［9］徐嬌，許文超，康占海，等.瓜果腐霉毒素對多年生黑麥草的致病作用機理初步研究［J］.草業學報，2009，18（4）：181－186.

［10］古麗君，徐秉良，梁巧蘭，等.生防木霉菌T2菌株對禾草腐霉病抑菌作用及機制研究［J］.草業學報，2011，20（2）：46－51.

［11］徐嬌，陳紅巖，石文偉，等.坪草腐霉枯萎病菌的生物學特性及誘變菌株毒素的除草活性研究［J］.河北農業大學學報，2008，31（4）：81－86.

［12］余永年，馬國忠.腐霉的生長溫度與分類［J］.云南農業大學學報，1990，5（2）：65－71.

［13］徐嬌，陳紅巖，石文偉，等.坪草腐霉枯萎病菌（Pythiumaphanidermatum）的生物學特性及誘變菌株毒素的除草活性研究［J］.云南農業大學學報，2008，31（4）：81－86.

［14］孫淑琴，劉水芳，楊秀榮.天津地區草坪腐霉枯萎病病原鑒定及生物學特性研究［J］.草原與草坪，2009，（3）：31－38.

［15］古麗君，徐秉良，梁巧蘭，等.蘭州市草坪禾草根腐病的發生及病原菌鑒定［J］.草業學報，2009，18（4）：175－180.

［16］徐秉良，郁繼華.非洲菊枯萎病菌的生物學特性［J］.甘肅農業大學學報，2002，37（1）：35－39.

［17］方中達.植病研究方法［M］.北京：中國農業出版社，1998.

［18］張俊忠，陳秀蓉，楊成德，等.東祁連山高寒草地土壤可培養真菌多樣性分析［J］.草業學報，2010，19（2）：124－132.

［19］鄭小波.疫霉菌及其研究技術［M］.北京：中國農業出版社，1997.

［20］張金林，龐民好，劉穎超，等.不同殺菌劑對草坪草病原菌毒力的作用測定［J］.草業學報，2006，15（1）：58－61.

［21］王國良.影響冷季型草坪腐霉病發生因子的研究［J］.浙江農業學報，2000，12（3）：136－139.

［22］譚鵬，張學忠.草坪主要病害的發生與防治［J］.陜西林業科技，2005，（2）：41－44.

［23］顧愛星，范燕敏，武紅旗，等.天山北坡退化草地土壤環境與微生物數量的關系［J］.草業學報，2010，19（2）：116－123.