青藏高原東緣中國沙棘的克隆多樣性及克隆結構

許璐，蘇雪，董莉娜，張輝，陳紋，江龍龍，劉涇霞，孫坤

（西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州730070）

＊無性生殖習性是植物界普遍存在的一種現象，具無性生殖習性的植物（克隆植物）具有可塑性強、繁殖速度快的特點，可在短期內占據各種不同生境，尤其是不良環境［1］，對物種的生存具有重要的意義。很多植物種類可以通過克隆生長產生與母株遺傳上完全相同的后代［2，3］，產生的無性系分株成活率高，提高了其在非最適條件，尤其是在惡劣環境條件（如高山和極地地區）下的生存力［4］。植物種群的克隆結構及克隆多樣性是進化過程中適應環境的結果，深入研究種群的克隆結構及克隆多樣性對了解克隆植物的種群形成、維持和衰退機制等有重要意義［5，6］。由于在野外精確鑒定克隆基株存在很大難度，嚴重制約了植物克隆結構和克隆多樣性的研究。近年來，一些基于PCR的DNA分子標記技術的發展為準確鑒定克隆基株提供了可靠的技術保障，已開始被用于植物克隆多樣性及克隆結構的研究［7－9］。

中國沙棘（Hippophaerhamnoidesspp.sinensis）為我國的特有類群，是群落演替的先鋒物種，具有重要的水土保持和經濟價值，主要分布于海拔400～3 100（3 900）m的山坡、草甸、谷地、河岸或干涸河床，在青藏高原東緣至黃土高原極為普遍。中國沙棘可通過根的萌蘗進行克隆繁殖，其根系主要由垂直根系和水平根系組成，克隆繁殖主要通過水平根系進行。迄今為止，對中國沙棘克隆生長的研究主要集中在外源激素、土壤水分對中國沙棘栽培群體克隆生長的影響［10，11］、中國沙棘克隆生長的生態學意義［12］和種群穩定性維持途徑［13］等方面，而對自然生長的中國沙棘居群克隆結構和克隆多樣性仍缺乏了解。為此，本研究使用RAPD作為遺傳標記，對青藏高原東緣甘南藏族自治州的8個中國沙棘自然居群的克隆多樣性和克隆結構進行了初步研究，旨在揭示沙棘屬植物的克隆繁殖能力和克隆分布特點，并為探討高山克隆植物對環境的適應性策略提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究地點位于青藏高原東緣的甘肅省甘南藏族自治州合作市境內，平均海拔3 000m，屬典型的高原大陸性氣候，年平均降水量400～800mm，多集中于5－9月，年平均氣溫1～3℃［14］。分布于甘南的中國沙棘群落平均株高為1～5m，灌木層蓋度60%～95%，草本層蓋度50%～80%。在合作市郊和黨智溝分別選取中國沙棘自然居群各4個，設置大小為5m×6m的樣方，在樣方內間隔1m進行個體采樣，并詳細繪制所采個體在居群內的位置（圖1），摘取新鮮、無蟲斑和病斑的幼嫩葉片，硅膠快速干燥后用于DNA提取。在野外調查并記錄中國沙棘居群平均株高、群落優勢種及生境的特征。具體采樣地點及居群特征見表1。

圖1 8個中國沙棘居群的克隆空間分布Fig.1 Clonal spatial distribution of eight H.rhamnoides populations

表1 中國沙棘采樣地點及生境條件Table 1 The habitats in sampling sites of H.rhamnoides spp.sinensis

1.2 總DNA的提取與檢測

采用改良的 CTAB法提取樣品總 DNA［15］，0.8%瓊脂糖凝膠檢測DNA樣品濃度，用去離子的滅菌水稀釋DNA至20ng／μL左右，置于4℃冰箱備用。

1.3 引物的篩選及PCR擴增和產物檢測

采用陳紋［16］在沙棘屬遺傳多樣性研究中篩選出的14條可以在中國沙棘居群內擴增形成清晰、穩定、重復性高、多態性豐富的隨機引物作為擴增引物（表2）。

每個居群對全部個體進行PCR擴增。采用10 μL的反應體系：DNA模板（5ng／μL）2μL；10×擴增緩沖液（500mmol／L Tris－HCl pH 8.3，2.5mg／mL的牛血清白蛋白（BSA），20mmol／L MgCl2）1μL；各200μmol／L dNTPs（上海Sangon生物工程公司）1μL；ED（10mmol／L Tris－HCl pH 8.3，2.5mg／mL BSA）1 μL；0.1μL（5U／μL）TaqDNA聚合酶（上海Sangon生物工程公司）；15ng／μL引物（上海Sangon生物工程公司）2μL；10%Ficoll（10mmol／L酒石黃，75μg／μL Ficoll 400）1μL；滅菌水1.9μL。PCR反應在德國產Biometra PCR儀上進行。擴增程序為：95℃60s；95℃5s，37℃40s，72℃70s，1個循環后，95℃5s，37℃40s，72℃70s，39個循環，最后延伸72℃4min。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，UVI凝膠圖像分析儀觀察并照相。

表2 用于中國沙棘克隆結構研究的引物及序列Table 2 Sequences of primers used in analysis of H.rhamnoides spp.sinensis clonal structure

1.4 數據統計與分析

根據產物在電泳圖譜中的位置，按擴增陽性（1）和擴增陰性（0）記錄電泳譜帶，出現擴增條帶的記為1，相應位置無擴增條帶的記為0，形成RAPD表型的0／1數據矩陣。應用NTSYS軟件計算J＆C遺傳距離。居群內個體間遺傳距離為0表示基因型相同，確定為同一基株克隆形成的不同分株。

中國沙棘的克隆多樣性水平用以下3個指數來判斷：

1）基因型比率（PD）［17］：PD＝G／N，其中G表示應用RAPD標記所能檢測到克隆繁殖的基因型，即基株數；N表示樣本數；由于PD受采樣策略和分株數目的影響，所以同時采用另一個更為客觀的指數來衡量克隆多樣性，即G／n，其中n為克隆繁殖形成的分株個數［18］。

2）Simpson’s多樣性指數（D）：通過Simpson多樣性指數可以估計居群內克隆的多樣性水平［19］。公式為：D＝1－｛∑ni（ni－1）］／［N（N－1）］｝［20］。式中，ni表示基株i形成的分株數目；N為檢測的樣本數。D的變化范圍在0（居群由1種基因型構成）～1（居群內每一分株都由不同的基株形成）。

3）Fager’s指數（E）［21］：用來描述居群內不同基因型分布的均度。可由下式計算得出：E＝D／Dmax，其中Dmax＝［N（n－1）］／［n（N－1）］。n表示每克隆繁殖形成的克隆數；N表示檢測的樣本數。

2 結果與分析

2.1 中國沙棘RAPD擴增

用14條隨機引物對8個中國沙棘居群共184個個體進行PCR擴增，14條隨機引物平均形成55.75種條帶，平均有15.13種條帶在中國沙棘居群內表現出多態性，平均多態條帶百分率為27.64%。

2.2 克隆多樣性

中國沙棘居群不同基因型比例（G／n）從0.15到0.67不等（表3），平均為0.35，G6居群最高，G5居群最低；基因型比率（PD）平均為0.14；Simpson’s多樣性指數在G3、G6居群最高（0.99），G5居群的最低（0.69），平均為0.85。中國沙棘居群的Fager’s均勻度指數（E）的平均值為0.87，各居群的E值為0.70～1.00。

表3 中國沙棘居群的克隆多樣性Table 3 Clonal diversity in populations of H.rhamnoides spp.sinensis

2.3 克隆大小與克隆分布

8個中國沙棘居群共鑒別出26種不同的基因型（基株）。26種基株通過克隆繁殖形成的分株數分別為1～12個，共形成89個分株（表4）。中國沙棘各居群可檢測到的產生克隆分株的基株數平均為3.25個，平均克隆大小為每基株形成3.4個分株，65%的基株可形成1個以上的分株。

中國沙棘居群內同一基株形成兩分株間的最大距離為5.8m，最小距離為1.0m。每基株形成分株之間最大距離的平均為3.4m。26種基株形成的89個分株間的總距離為138.2m，每克隆內分株間的平均距離為1.75 m；同一克隆內分株間的總距離為1.0～15.3m。8個中國沙棘居群的具體克隆分布情況如圖1。總體上，中國沙棘同一基株產生的克隆分株間的距離較大，分株的分布比較離散，即克隆分布主要為游擊型（guerilla growth form）分布。中國沙棘居群內能夠進行克隆繁殖的基株數目（克隆數目）為2～4個，但各居群內的克隆繁殖卻主要是由其中1種基株為主進行的，如基株類型g1－1、g2－1、g4－1 、g4－2 、g5－1 、g7－1 和g8－1在各居群中產生的分株數和分株的擴散能力都占優勢（表1，圖1）。不同基株形成分株的能力和分布特點表明中國沙棘的克隆繁殖主要是以某一優勢基株類型為主的方式。

2.4 居群株高和群落結構對中國沙棘克隆多樣性的影響

中國沙棘的克隆多樣性指數與居群株高之間表現出一定的相關性。除居群G3（平均株高3m）外，隨著居群平均株高的增加，克隆多樣性水平有下降的趨勢（圖2）。居群G5的平均株高最大，在4m左右，但Simpson’s多樣性指數（D）、G／n值在8個居群間最低。最年輕的居群G6（平均株高1m）的G／n和D值最高。另外，分布于林緣灌叢類型為鮮黃小蘗＋中國沙棘的G3和G4居群相對于其他以中國沙棘為單優勢種的灌叢中分布的中國沙棘居群具有較高的Simpson’s多樣性指數，D值分別為0.99和0.92。同一地點的中國沙棘自然居群，克隆多樣性與海拔之間并未表現出規律性的變化。

3 討論

3.1 中國沙棘克隆多樣性

植物的克隆多樣性與其繁殖特性有關［22］，中國沙棘為雌雄異株、風媒傳粉的木本植物，可通過根的萌蘗進行克隆繁殖。與同是木本、雌雄異株的植物［如櫟屬的Quercuschrysolepis、歐洲山楊（Populustremula）［18，23］］相比，青藏高原東緣的中國沙棘自然居群檢測到的克隆多樣性指數較低：基因型比率（PD）平均值為0.14；Simpson’s多樣性指數（D）平均值為0.85；Fager’s均勻度指數（E）平均值為0.87。水生植物具有很強的克隆繁殖能力，Chen等［24］應用RAPD分子標記對水生植物寬葉澤苔草（Caldesiagrandis）克隆多樣性的檢測結果為PD＝0.37，D＝0.91，E＝0.78。本研究結果表明，中國沙棘居群的克隆多樣性也低于水生植物寬葉澤苔草的克隆多樣性水平。可見，中國沙棘的克隆繁殖能力較強。本研究的8個中國沙棘居群都生長于高山環境，克隆繁殖占有一定的優勢是其適應高寒環境的繁殖對策。克隆生長可以使克隆植物同一基因型內資源共享與風險分攤，通過頂端優勢減小克隆分株內的競爭，相對精確的分株放置和空間入侵，并迅速吸收有限資源并儲備供將來使用以及能有效地尋找空間，利用異質性生境，增加了種群適合度［25，26］。

表4 中國沙棘各居群內的克隆數及克隆分株間的距離Table 4 Clones number and the distance between ramets in populations

圖2 居群內平均株高與克隆多樣性的關系Fig.2 Relationship between average plant height and clonal diversity

3.2 中國沙棘克隆大小和分布

本研究的8個中國沙棘居群均表現出一定的克隆擴散能力（表4），表現為每克隆內分株間的平均距離為1.75m，同一克隆內分株間的最大距離可達到15.3m，平均克隆大小為每基株形成3.4個分株，65%的基株可形成1個以上的分株。Suvanto和Latva－Karjanmaa［23］研究發現風媒傳粉雌雄異株的木本植物歐洲山楊每基株可形成分株2.1個，能夠形成1個以上分株的基株占64%。同為風媒傳粉、雌雄異株的木本植物中國沙棘居群的平均克隆大小要高于歐洲山楊。中國沙棘同一基株的克隆分株間的距離較大，分株的分布比較離散，其克隆分布主要表現為游擊型的分布特點。游擊型克隆植物具有很強的克隆擴散能力，宜于利用分散分布的資源，屬于資源開拓型［27，28］。這一分布特點有助于其在異質的高原環境下積極尋找適宜的生存條件。

青藏高原東緣的中國沙棘克隆繁殖主要表現為居群內存在以優勢基株為主的克隆擴增。不同居群包含的克隆數目雖然為2～4個，但是每基株擁有的分株數卻從1～12個不等，并且在多數的居群中都有1～2種基因型占據相當大的比例。青藏高原邊緣自然分布的中國沙棘往往形成密集的沙棘灌叢，群落形成過程中的競爭主要是在種內個體之間進行，個體間的自疏現象影響了中國沙棘的克隆大小。不同的克隆（基因型）對環境具有不同的適應性，那些適應生長環境的克隆個體勢必會在整個居群中長期占有優勢，這可能是中國沙棘克隆繁殖過程中存在優勢基株類型的原因。

3.3 中國沙棘克隆多樣性和克隆結構的影響因素

種群年齡和生態因子等都會影響植物的遺傳分化、克隆多樣性和克隆分布［6］。研究表明，中國沙棘居群的定居時間可能對克隆多樣性存在有明顯的影響。中國沙棘居群的平均株高在一定程度上可以反映居群的相對定居時間。總體上中國沙棘居群在定居的早期（如居群G6），其克隆多樣性較高，克隆繁殖現象不明顯。當居群內的植株形成高大喬木，整個居群處于穩定的生長階段時，克隆繁殖則占有絕對優勢。這可能是由于隨著定居時間的增加，居群內競爭能力較強的植株通過克隆繁殖，形成更多的分株，獲得最佳的生存資源，排擠居群內的其他植株并抑制其克隆繁殖，形成了某一優勢基株占優勢的分布特點。草本植物蛇莓（Duchesneaindica）的克隆繁殖也表現出在種群建立不久有最高的克隆多樣性，隨著時間的推移，種群中克隆多樣性逐漸降低［29］。環境的變化可以調節有性繁殖和克隆繁殖之間的平衡，是影響居群克隆多樣性和克隆結構的一個機制［30］。中國沙棘的克隆多樣性與生境之間表現出一定的聯系。例如，居群G5是生長于河灘的以中國沙棘為優勢種的沙棘灌叢，水源充足，不存在種間競爭，其長勢旺盛，克隆繁殖現象明顯，Simpson’s多樣性指數和均勻度E在8個居群中都最低，且同一克隆分株間的總距離高達15.3m，由1個優勢基株（G5－1）形成了12個分株。而分布于林緣陰坡和半陰坡的居群G3和G4則表現出了較弱的克隆繁殖能力。這2個居群均生長于以鮮黃小蘗和中國沙棘為共優種的灌叢，群落內存在較強的種間競爭可能是中國沙棘居群內克隆繁殖受到一定程度抑制的原因。Nicotra和Rodenhouse［31］也提出植物對資源可利用性的競爭會影響克隆植物的多樣性。另外，前人對蛇莓［29］和菊科Rutidosis leiolepis［32］的研究表明，其克隆繁殖能力隨著海拔的升高而增強。但本研究對合作黨智溝和市郊2個樣地不同海拔中國沙棘克隆多樣性的研究表明，其克隆多樣性與海拔之間沒有表現出明顯的相關性。本研究中，兩樣地中國沙棘的海拔僅有100～250m，海拔不明顯可能是未檢測到其克隆多樣性與海拔之間相關性的原因，今后還需要進行更深入的研究才能揭示中國沙棘克隆多樣性與海拔之間是否存在相關性。

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