一氧化氮合酶基因多態性與吉林省漢族人群冠心病的關系研究

[摘要] 目的 研究內皮型一氧化氮合酶基因多態性與冠心病的關系。 方法 收集120例患有冠心病的患者和102例年齡、性別相匹配的健康對照者， 采用聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態性分析其多態性并確定基因型。 結果 冠心病組eNOS基因的（TT+TG）基因型明顯的高于正常對照組（OR = 2.02，95％CI：1.09-3.75，P < 0.05），兩組等位基因T差異具有統計學意義（OR = 1.96，95%CI：1.14~3.36，P < 0.05）。 結論 eNOS基因G894T基因多態性與冠心病發病有關。

[關鍵詞] 冠心病；動脈粥樣硬化； 基因多態性；eNOS

[中圖分類號] R541.402 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）03-0087-02

Association study between the polymorphisms of nitric oxide synthase gene and coronary heart desease in Jilin Province

YU Wei

The People's Hospital of Changchun City in Jilin Province， Jilin 130051，China

[Abstract] Objective To investigate the risk of coronary heart desease with endothelial constitutive nitric oxide synthase gene polymorphisms. Methods We investigated the G894T mutations in the eNOS gene in 120 Chinese patients with coronary heart desease and 102 age- and sex-matched healthy controls. Its genotype was defined by the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis. Results The (TT+TG) genotype of eNOS in the coronary heart desease group were higher than control group（OR = 2.02， 95％CI: 1.09-3.75， P < 0.05）.The allele gene T had statistical meaning in two group(OR=1.96， 95％ CI: 1.14-3.36， P < 0.05）. Conclusion There is a synergistic effect of eNOS gene polymorphisms in patients with coronary heart desease.

[Key words] Coronary heart desease; Atherosclerosis; Polymorphism; eNOS

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（CAD）已成為許多中老年人死亡的一個最常見原因，并且與遺傳因素密切相關。故應用分子生物學方法來研究基因致病已逐步成為熱點。NO具有抗平滑肌細胞增殖、抑制血小板聚集和白細胞粘附、擴張血管、調節血壓的作用[1]。決定NO合成的關鍵酶是一氧化氮合酶（NOS），內皮源性一氧化氮合酶（eNOS）的基因多態性已被證實，并且與NO生成量的降低有關[2]。我們研究吉林漢族人群冠心病的eNOS基因多態性，用以探討eNOS基因多態性與冠心病的關系。

1 對象與方法

1.1 對象

收集2009年1月~2010年6月于我院心內科確診的冠心病患者120例，年齡（62.93±10.14）歲；同時選擇年齡和性別相匹配的健康體檢者102作對照，年齡（63.69±11.13）歲。病例組均符合1979年WHO制定的關于缺血性心臟病的診斷標準。對照者均無心腦血管病史。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成與設計 采用Lv等[3]針對eNOS基因G894T多態性設計的一對引物，由上海生工生物工程公司合成。上游引物：5’-AAG GCA GGA GAC AGT GGA TGG A-3’；下游引物：5’-CCC AGT CAA TCC TTT GGT GCT CA-3’。

1.2.2 基因組DNA提取 抽取冠心病患者及正常對照者空腹狀態下的全血5mL加EDTA抗凝，采用鹽析法來提取基因組DNA，保存于-20℃冰箱。

1.2.3 PCR反應條件及擴增體系 ①PCR反應條件： 94℃預變性4 min，94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環，最后72℃延伸4 min. ②PCR擴增體系：10X PCR緩沖液2 μL，5 μmol/L上下游引物混合液3 μL ，TaqDNA聚合酶0.25 μ/uL，2 mol/L dNTP 2 uL，待測模板DNA l μL，補水至20 μL。

1.2.4 擴增產物的酶切 總反應體系為20 μL，其中10X緩沖液2 μL，PCR產物l0 μL， 內切酶BanII 6 u，其余用無菌水補充，在37℃條件下水浴16 h 。酶切產物用EB染色，3％瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像系統下觀察結果。

1.2.5 血脂和血糖測定 所有測定結果均來自于我院。

1.3 統計學方法

統計軟件采用SPSS 11.5。等位基因頻率用基因計數法，組間基因型與等位基因頻率比較用χ2 檢驗，用比值比（OR）及95％可信區間（CI）表示相對風險度。計量資料用（x±s）表示，各組間數據的比較用t檢驗。

2 結果

2.1 冠心病組與對照組臨床特征比較

冠心病組的血壓、血脂、血糖以及吸煙者比例與對照組比較有統計學意義（P < 0.05），平均年齡和性別構成無統計學意義。見表1。

2.2 eNOS基因型分析

根據限制性內切酶BanII酶切的情況，eNOS G894T基因型有三種，即完全酶切的GG型（320bp、137bp 2條帶）；部分酶切的TG型（457 bp、320bp、137 bp 3條帶）和完全不被酶切的TT型（457 bp 1條帶），見圖1。

2.3 冠心病組與對照組eNOS基因多態性的比較

冠心病組的TT+TG基因型顯著高于對照組（OR =2.02，95％CI：1.09~3.75；P < 0.05）。eNOS G894T基因型在兩組中的分布差異有統計學意義。冠心病組的T等位基因頻率亦顯著高于對照組（OR = 1.96，95％ CI：1.14~3.36；P<0.05）。見表2。

3 討論

NO是由L-精氨酸和分子氧在NOS催化下生成的，具有顯著的血管擴張作用。另外，它還能抑制血小板聚集和白細胞黏附，并且能夠阻止平滑肌細胞的遷移和增生，從而阻止血管動脈硬化[4]。冠心病的病理基礎是冠狀動脈粥樣硬化。NO 生成和釋放減少，則可導致血小板等有形成分大量黏附聚集形成血栓，平滑肌細胞大量增生和遷移，從而加速動脈粥樣硬化。eNOS基因G894T多態性已被證實，即在第7外顯子處的第894位G被T替代，導致密碼子298處谷氨酸（Glu）被天門冬氨酸（Asp）替代[5]。Lembo研究亦發現頸動脈斑塊的形成是由于Asp298的純合子在eNOS基因上的錯義表達所致[6]。eNOS基因第7外顯子第894位G被T替代，密碼子298位上的谷氨酸即由天門冬氨酸替代，產生了eNOS基因的錯義表達，于是導致NO合成減少，從而引起頸動脈粥樣斑塊形成。eNOS基因G894T多態性是頸動脈斑塊的獨立危險因子。因此，冠心病的發生、發展可能與eNOS 變異有關。

本研究顯示，吉林省漢族人群中冠心病組的TT+TG基因型顯著高于對照組（OR = 2.02，95％CI:1.09~3.75；P < 0.05)。eNOS G894T基因型在兩組中的分布差異有統計學意義。冠心病組的T等位基因頻率亦顯著高于對照組（OR = 1.96，95％ CI：1.14~3.36；P < 0.05）。提示T等位基因可能是冠心病的遺傳易感基因。更進一步證實中國人的eNOS基因多態性與冠心病有相關性。

[參考文獻]

[1] Niwa M ，Inao S，Takayasu M ，el a1． Time course of expression of three nitric oxide syntbase soforms after transient middle cerebra1artery occlusion in rats[J]． Neurol Med Chir （Tokyo），2001，41（2）：63-72．

[2] Tsukada T，Yokoyama K，Arai T， et a1. Evidence of association of the ecNOS gene poly morphism with plasma NO metabolite levels in humans[J]．Biochem Biophys Res Commun， 1998， 245（1）：190-193.

[3] 呂浩，雷霆，趙琳，等． 腦梗死與一氧化氮合酶基因多態性的關系[J]． 中國臨床康復，2004，8（22）：4469-4471.

[4] Macleod MJ，Dahiyat MT，Cumming A． No association between Glu/Asp polymorphism of NOS3 gene and ischemic stroke[J]． Neurology， 1999，53 （2）：418-420.

[5] Shimasaki Y，Yasue H，Yoshimura M，et al. Association of the missense Glu298Asp variant of the endothelial nitric oxide synthase gene with myocardial infarction[J]. J Am Coll Cardial，1998，31（7）：1506-1516.

[6] Lembo G， De Luca N， Battagli C，et al． A common vLriant of endothelial nitric oxide Synthase （Glu298Asp） is an independent risk factor for carotid atherosclerosis[J]. Stoke，200l，32（3）：735-740.

（收稿日期：2011-11-21）