重組人促紅細胞生成素對大鼠急性創傷性腦損傷腦組織中基質金屬蛋白酶-9及水通道蛋白-4表達的影響

[摘要] 目的 探討重組人促紅細胞生成素（rhEPO）對大鼠急性創傷性腦損傷的神經保護作用及其機制。 方法 健康雄性SD大鼠55只隨機分為假手術組（n = 5）、對照組（n = 25）和EPO治療組（n = 25）；對照組和治療組采用改進的Feeney等的方法制作腦創傷模型，EPO治療組在模型建立后立即腹腔注射rhEPO 5000 U/kg，對照組和假手術組在等時間點給予等量生理鹽水。根據傷后處死時間點不同每組再分為5個亞組，即6 h、24 h、48 h、3 d、7 d組，每個亞組5只動物。斷頭、取腦，行HE染色和免疫組織化學方法檢測大腦皮層組織中基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）及水通道蛋白-4（AQP-4）的表達。 結果 腦創傷大鼠6 h創傷灶腦組織出現MMP-9和AQP-4的表達。與假手術組比較，差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。EPO治療組和對照組相比較MMP-9及AQP-4的表達明顯降低（P < 0.05）。 結論 rhEPO對大鼠急性創傷性腦損傷有一定的神經保護作用，其機制可能是通過降低MMP-9及AQP-4的表達來實現的。

[關鍵詞] 急性創傷性腦損傷；促紅細胞生成素；基質金屬蛋白酶-9；水通道蛋白-4

[中圖分類號] R363 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2012）03-0004-03

Effects of rhEPO on expression of MMP-9 and AQP-4 in brain tissues of rats with acute traumatic brain injury

ZHOU Peng1△ HAO Jiehe2▲

1.Department of Postgraduates， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China；2.Department of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030000， China

[Abstract] Objective To explore the neuroprotective mechanisms of recombinant humam erythropoietin (rhEPO) on the rats after acute traumatic brain injury. Methods Fifty-five healthy adult male SD rats were randomly dividied into sham operation group (n = 5)， control group (n = 25) and the EPO treatment group (n = 25). The traumatic brain injury of the latter two groups was induced by Feeney's. rhEPO treatment group underwent intraperitoneal injection of 5000 U/kg rhEPO after the injury. The rats in the control group and the EPO treatment group were redivided into 5 subgroups (6 h、24 h、48 h、3 d、7 d groups) of 5 rats each respectively according to different time after the injury. The histology was detected by HE staining， the expression of MMP-9 and AQP4 was detected by immunohistochemical. Results The expression of MMP-9 and AQP-4 in the brain tissue of the injury appeared 6 hours after trauma and was significantly higher in the injury group than that in the sham operation group (P < 0.05). The expression was significantly lower in rhEPO treatment group than that in control group (P < 0.05). Conclusion Recombinant human EPO may be neuroprotective against acute traumatic brain injury in rats， probably by inhibiting the activities of MMP-9 and AQP-4.

[Key words] Acute traumatic brain injury; Erythropoietin; Matrix metalloproteinase-9; Aquaporin-4

急性創傷性腦損傷是神經外科最常見疾病之一，致死、致殘率高，嚴重威脅著人類生存及生活質量。創傷后的血腦屏障完整性的破壞是顱腦創傷后的主要病理改變，是導致血管源性腦水腫、炎性反應等各種繼發性病理改變的病理基礎。炎癥反應和腦水腫在創傷后繼發性腦損傷的發展過程中發揮重要作用，是影響腦創傷發展和預后的兩個重要因素。MMP-9是最重要的細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）降解酶之一，其作用使細胞外基質降解的正常平衡被破壞，參與血腦屏障破壞、炎性反應、腦水腫形成和髓鞘脫失等病理過程[1]。AQP-4是腦內最主要的水通道蛋白，起著調節腦內水轉運的重要功能，與腦水腫的形成密切相關[2]。最近研究證明EPO在抗炎癥反應、減輕腦水腫、促進神經生長、改善神經功能方面具有積極的神經保護作用[3]。本實驗主要通過研究EPO對AQP-4和MMP-9在大鼠急性創傷性腦損傷表達的影響來進一步證實其對急性創傷性腦損傷的神經保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑 重組人促紅細胞生成素（rhEPO）注射液購于北京四環生物制藥有限公司。AQP-4、MMP-9兔抗鼠多克隆抗體和二步法免疫組織化學檢測試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.2 動物及分組 健康雄性SD大鼠55只（山西醫科大學實驗動物中心提供），體質量約250～300 g。隨機分為假手術組（n = 5）、對照組（n = 25）和EPO治療組（n = 25）；對照組和EPO治療組又按處死時間點不同即傷后6 h、24 h、48 h、3 d和7 d分為五個亞組，每個亞組5只。

1.2 實驗和檢測方法

1.2.1 腦創傷模型制作 采用改進Feeney法自由落體硬膜外撞擊方法造致傷模型。大鼠稱重后，10%水合氯醛（35 mg/kg）腹腔注射麻醉，頭部固定于立體定向儀上，無菌條件下暴露右頂骨，于矢狀縫中線旁開2.5 mm、冠狀縫后1.5 mm處，牙科臺式電鉆鉆孔擴大成直徑5.0 mm的類圓形骨窗，保持硬腦膜完整，放置撞擊圓錐，將40 g砝碼置于15 cm高處呈自由落體撞擊，造成局灶性中度腦挫裂傷，切口處消毒，縫合頭皮。假手術組僅切開頭皮，開骨窗，不造成腦損傷。動物模型制作成功后，EPO治療組立即腹腔注射人重組EPO 5000 U/kg，假手術組和對照組均腹腔注射等量的生理鹽水。術畢各組動物頭部消毒后放回籠內飼養，正常喂食水。

1.2.2 神經行為評定 大鼠顱腦損傷后行神經功能評分（neurological severity score，NSS）[4]。運動測試6分，感覺測試2分，直杠平衡測試6分，反射缺失或者異常活動4分，最高分數18分，最低分數0分。將術后評分為7～12分的老鼠納入中度創傷性腦損傷模型，否則棄之不用。

1.2.3 制備石蠟切片和HE染色 各組在相應時間點以10%水合氯醛（0.5 mL/kg）麻醉大鼠后，剪開胸腔暴露心臟，先用37 ℃生理鹽水200 mL經心臟灌注，同時剪開右心耳，再用4%多聚甲醛200 mL灌注固定后斷頭取腦，經10%中性甲醛固定24 h后，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋腦組織標本。大鼠腦組織標本冠狀面連續切片，厚度5 μm，HE染色方法嚴格按說明書染色步驟進行，光鏡下觀察細胞、組織排列及變化并照相。

1.2.4 MMP-9和AQP-4測定 采用抗生物素-生物素-過氧化物酶復合法（SABC）檢測MMP-9和AQP-4的陽性表達。MMP-9和AQP-4兔抗鼠抗體（一抗）其工作效價1︰200；切片常規脫蠟，過氧化氫封閉，微波抗原修復20 min，血清封閉，分別滴加兔抗鼠MMP-9和AQP-4一抗，室溫孵育60 min。0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）洗5 min、3次，然后滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體（二抗），室溫孵育20 min，PBS洗5 min、3次，DAB溶液顯色，鏡下控制反應時間，自來水終止反應，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。免疫組化染色的切片行光鏡檢查，觀察其染色強度，MMP-9和AQP-4陽性細胞表現為細胞漿呈棕色。在多功能顯微鏡下隨機選取5個200×不重復視野進行照相，圖像資料使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定每個視野陽性染色區域的細胞數。

1.3 統計學處理

采用SPSS13.0統計軟件包進行統計分析，實驗數據用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及組間兩兩比較，方差不齊者采用非參數Kruskal Wallis檢驗，P < 0.05表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經行為評定

大鼠在顱腦損傷后立即出現前肢抱握屈曲、后肢強直、肌張力增高、不能直走、向一側打轉等表現。清醒后精神萎靡不振，活動減少。術后神經功能評分均在7～12分之間。

2.2 組織學觀察

光鏡下見假手術組皮層神經細胞呈圓形或橢圓型，核膜完整，核仁清晰可見呈藍色淡染，周圍神經纖維致密，著色均勻。傷后6 h組可見神經元細胞腫脹，體積增大，核膜不清，核仁深染偏位或消失（圖1）。48 h組神經細胞周圍可見空隙，胞質強烈嗜伊紅，核固縮。胞質與胞核黏附在一起，稱為暗細胞，且數量增多，72 h組神經膠質細胞和組織間隙水腫明顯，大量的多型核白細胞和單核巨噬細胞積聚在水腫帶。神經元胞質呈嚴重缺血性改變。7 d組暗細胞數量減少。假手術組無明顯變化。

2.3 腦組織中MMP-9和AQP-4的表達

免疫組化染色結果顯示MMP-9隨著損傷時間的延長其表達明顯增強，48 h達高峰，以后逐漸下降，7 d時下降到最低（圖2），在假手術組幾乎不表達，EPO治療組各時間點表達明顯少于對照組（P＜0.05），見表1。AQP-4在損傷后，表達水平迅速升高，24 h達最高水平，48 h后開始下降，至7 d時仍高于正常水平（圖3），假手術組各時間點無變化，EPO治療組各時間點表達明顯少于對照組（P＜0.05）。見表1。

3 討論

目前對于急性創傷性腦損傷尚缺乏完善的治療方法，治療的關鍵還是控制繼發性腦損害的發展。近年來研究表明，EPO在腦外傷中可通過[3]抗凋亡、抗氧化、減輕腦水腫、促進神經細胞再生、減少興奮性氨基酸神經毒性、抗炎癥[5]和促進血管生成方面[6]等途徑對繼發性腦損害的發展發揮重要作用。本實驗主要通過研究EPO對大鼠急性創傷性腦損傷的保護作用，為臨床治療急性創傷性腦損傷奠定理論基礎。

MMP-9是MMPs中的重要明膠酶，在血管再生、炎性反應、血腦屏障（BBB）的破壞中起重要作用，正常腦組織中MMP-9表達水平極低[7，8]。在腦創傷后，神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞、內皮細胞和侵入的中性粒細胞均可大量表達。

AQP-4是促進水轉運跨膜蛋白家族中的重要一員，是腦內最主要的水通道蛋白，在大腦皮層呈低表達，主要在星形膠質細胞及室管膜細胞亞群中表達[9]，大鼠外傷性腦損傷損傷后誘發了血腦屏障的膠質細胞胞膜AQP4的表達，促進了體液能夠迅速通過毛細血管滲入神經組織間隙是導致腦水腫的病理機制之一[10]。

本實驗發現，大鼠腦損傷后，大腦皮層中的MMP-9和AQP-4的含量明顯增高，在不同的時間點含量不同，MMP-9在1～2 d達到高峰，3 d后開始逐漸降低。AQP-4在24 h達到高峰，3 d后開始降低。EPO治療組MMP-9和AQP-4含量均低于對照組，提示EPO有抑制MMP-9和AQP-4表達的作用。這說明急性創傷性腦損傷的發展過程與MMP-9和AQP-4的表達密切相關。也證實了EPO可通過降低腦損傷后血清MMP-9和AQP-4含量，來抑制顱腦損傷后炎癥反應的發生和腦水腫的發展，從而發揮神經保護作用。

EPO的主要作用是促進紅細胞生成，長期、反復、大量的用藥將會導致血液黏稠、靜脈血栓、中風的發生。最近Erbayraktar等[11]報道已經研制出了缺乏唾液酸基的EPO，它無生成紅細胞的功能，半衰期短，能通過血腦屏障，在神經系統內有完全的神經保護作用。通過對EPO神經保護機制進行更深層次的探索和臨床實驗，從而為進一步探討外傷性腦損傷的發生機制及尋覓更有效的神經保護措施提供了實驗基礎。

[參考文獻]

[1] 李季林，陳雪林，盛羅平. MMP-9與顱腦損傷的最新研究進展[J]. 中華全科醫學，2011，9（2）：271-272.

[2] Papadopoulos MC，Krishna S，Verkmall AS，et al. Aquaporin water channel sand brain edema[J]． Mt Sinai J Med，2002，69（4）：242-248．

[3] 袁雪松、卞曉星. 促紅細胞生成素對外傷性腦損傷的保護作用[J]. 國際神經病學神經外科學雜志，2007，34（4）：88-91.

[4] Chen J，Li Y，Wang L，et al. Therapeutic benefit of intravenousadministration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats[J]. Stroke，2001，32（4）：1005-1011.

[5] Chen G，Shi JX，Hang CH，et al. Inhibitory effect on cerebral inflammatoryagents that accompany traumatic bra in injury in a ratmodel：a potential neuroprotective mechanism of recombinant humanerythropoietin （rhEPO）[J]. Neurosci Lett，2007，425（3）：177-182.

[6] Keogh CL，Yu SP，Wei L，et al. The effect of recombinant human erythropoietin on neurovasculature repair after focal ischemic stroke in neonatal rats[J]. Pharmacol Exp Ther，2007，322（2）：521-528.

[7] Wang X，Jung J，Asahi M，et al． Efects of matrixmet alloproteinase-9 gene knock out on morphological and motor outcomes after traumaticbrain injury[J]． J Neurosci，2000，20（18）：7037-7042．

[8] Wagner S，Nagel S，Kluge B，et a1． Topographically graded postis-chemic presence of metallopmteinases is inhibited by hypothermia[J]． Brain Res，2003，984（1/2）：63-75．

[9] Rash JE，Yasumura T，Hudson CS，et al. Direct immunogold labeling of aquaporin-4 in square arrays of astrocyte and ependymocyte plasma membranes in rat brain and spinal cord[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（20）：11981-11985.

[10] Sun MC，Honey CR，Berk C，et a1． Regulation ofaquaporin-4 in a traumatic brain injury model in rats[J]. J Neyrosurg，2003，98（3）：565-569．

[11] Erbayraktar S，Grasso G，Sfacteria A，et al. Asialoerythropoietin is a nonerythropoietic cytokine with broad neuroprotective activity in vivo[J]. Proc Natl A cad Sci USA，2003，100（11）：6741-6746.

（收稿日期：2011-11-22）