淋病奈瑟菌表面蛋白A克隆、表達(dá)和免疫原性鑒定

[摘要] 目的 克隆并構(gòu)建淋病奈瑟菌表面蛋白A（nspA）基因原核表達(dá)系統(tǒng)，并對(duì)重組產(chǎn)物rNspA進(jìn)行免疫原性鑒定。 方法 采用PCR擴(kuò)增nspA基因，構(gòu)建nspA基因原核表達(dá)系統(tǒng)。SDS-PAGE檢測(cè)目的重組蛋白rNspA表達(dá)情況，Ni-NTA親和層析法提純r(jià)NspA，免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)及Western Blot鑒定rNspA的免疫原性。 結(jié)果 克隆的nspA基因與GenBank中相關(guān)序列相似性為100%，rNspA表達(dá)量為細(xì)菌總蛋白的40.1%，提純的rNspA在SDS-PAGE后顯示為單一的蛋白條帶。rNspA抗血清免疫雙擴(kuò)散效價(jià)為1∶4，rNspA抗血清能有效識(shí)別rNspA。 結(jié)論 所構(gòu)建的nspA基因原核表達(dá)系統(tǒng)能高效表達(dá)rNspA，表達(dá)的產(chǎn)物有良好的免疫原性，為淋病奈瑟菌免疫疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 淋病奈瑟菌；nspA基因；克隆／重組表達(dá)；免疫原性鑒定

[中圖分類號(hào)] R759.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2012）03-0009-02

Construction and prokaryotic expression of Neisseria gonorrhoeae nspA gene and immunological identification of the expressed product

DU Peng WU Senlin ZHONG Yawen SUN Aihua

Zhejiang Medical College， Hangzhou 310053， China

[Abstract] Objective To clone nspA gene of N.gonorrhoeae and then construct its prokaryotic expression system， and to identify the immunogenicity of its product. Methods nspA gene was amplified by PCR and its prokaryotic expression system was then constructed. SDS-PAGE was used to measure the expression of target recombinant protein rNspA， Ni-NTA affinity chromatography was applied to extract rNspA. Double immunodiffusion and Western Blot assay were applied to indentify immunogenicity of rNspA. Results Sequence similarity of the cloned nspA gene was 100% compared to the corresponding sequence in GenBank. The expression output of rNspA was approximately 40.1% of the total bacterial proteins. The extracted rNspA showed a single protein band in gel after SDS-PAGE. The immunodiffusion titer of rabbit antiserum against rNspA was 1∶4. The rNspA antiserum was able to recognize rNspA. Conclusion The constructed prokaryotic expression system enable express rNspA with high efficiency， and can be used as a candidate antigen for developing genetic engineering vaccine.

[Key words] Neisseria gonorrhoeae; NspA Gene; Clone/recombinant expression; Immunogenicity/identification

淋病奈瑟菌感染引起的淋病發(fā)病率目前居于我國各類性傳播疾病首位[1]。淋病奈瑟菌感染后可產(chǎn)生特異性免疫力，但維持時(shí)間短導(dǎo)致重復(fù)感染。研究認(rèn)為淋病奈瑟菌免疫逃逸機(jī)制可能與該菌外膜蛋白抗原多態(tài)性相關(guān)[2]。

1999年P(guān)lante等研究發(fā)現(xiàn)淋病奈瑟菌表面蛋白A（Neisseria gonorrhoeae surface protein A，NspA）氨基酸序列淋病奈瑟菌之間同源性高達(dá)98%[3]。Plante等用放射性標(biāo)記的NspA抗體檢測(cè)NspA在細(xì)胞膜表面的暴露情況表明淋球菌NspA位于完整的細(xì)菌表面[3]，可見NspA能在菌體表面持續(xù)表達(dá)，抗原高度保守并具有較強(qiáng)免疫原性，是一個(gè)很好的淋球菌疫苗候選者。本研究選擇淋病奈瑟菌表面蛋白A作為研究對(duì)象，通過克隆nspA基因、重組表達(dá)rNspA蛋白、采用Ni-NTA親和層析技術(shù)提純重組蛋白rNspA，以期為后繼淋病奈瑟菌疫苗研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及載體

淋病奈瑟菌標(biāo)準(zhǔn)株WHO-A、表達(dá)宿主菌E.coli BL21DE3和原核表達(dá)載體pET42均由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物系提供。PCR試劑盒和pMD18-T由TaKaRa公司提供。DNA小量快速純化試劑盒由BioColor公司生產(chǎn)。

1.2 目的基因nspA的提取及擴(kuò)增

新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物經(jīng)PBS洗滌后離心取沉淀，用基因組提純?cè)噭┖校˙ioColor）提取DNA。參考淋病奈瑟菌標(biāo)準(zhǔn)株WHO-A（GenBank：AY157539.1）nspA基因序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增nspA基因全長的上下游引物，結(jié)合內(nèi)切酶圖譜設(shè)置酶切位點(diǎn)。上游引物序列：5’-CGC GGA TTC （BamH I）ATG AAA AAA GCA CTT GCC GCA-3’，下游5’-CGC AAG CTT（Hind Ⅲ）CTA TCA GAA TTT GAC GCG CAC GCC-3’，引物委托上海invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。PCR總體積為100 μL，內(nèi)含各dNTP 2.5 mmol/L、上下游引物各250 nmol/L、Taq酶2.5 U、淋病奈瑟菌基因組DNA模板100 ng、1×PCR緩沖液（pH8.3）。PCR參數(shù)：94℃ 5 min；94℃ 變性30 s、54℃ 退火30 s、72℃ 延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 T-A克隆和核苷酸序列測(cè)定

用DNA小量快速純化試劑盒提純上述nspA基因PCR產(chǎn)物，將目的擴(kuò)增片段克隆至pMD18-T中形成重組質(zhì)粒pMD18-TnspA，轉(zhuǎn)化入E.coli DH 5α株并經(jīng)氨芐抗性和藍(lán)白斑雙重篩選，堿變性法提取質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定后測(cè)序。

1.4 nspA基因原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

采用小量堿變性法提取測(cè)序結(jié)果有正確插入序列的重組質(zhì)粒pMD18-TnspA，BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-TnspA，獲得的目的基因片段，按5∶1比例將獲得的目的基因片段nspA和線性化的表達(dá)載體pET42a混合，用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于表達(dá)宿主菌E.coli BL21中形成目的基因表達(dá)系統(tǒng)E.coli BL21pET42a-nspA，提取重組質(zhì)粒雙酶切后再次測(cè)序。

1.5 目的重組蛋白rNspA的表達(dá)和純化

測(cè)序結(jié)果正確的E.coli BL21pET42a-nspA在含50 μg/mL卡那抗性的LB培養(yǎng)液中37℃振蕩培養(yǎng)4 h后，加入誘導(dǎo)劑IPTG使終濃度為1.0 mmol/L，37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h。采用SDS-PAGE聯(lián)合Bio-Rad凝膠圖像分析系統(tǒng)測(cè)定rNspA表達(dá)量，采用Ni-NTA親和層析法提純表達(dá)的目的蛋白rNspA，紫外線分光光度法測(cè)定蛋白濃度。

1.6 重組蛋白rNspA免疫原性分析

將2 mg rNspA與弗氏佐劑混合，每次間隔1周皮內(nèi)多點(diǎn)免疫家兔3次，末次免疫后10 d心臟采血后分離血清，采用免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)其效價(jià)。Western Blot檢測(cè)rNspA的免疫原，10%SDS-PAGE鑒定重組蛋白rNspA并電轉(zhuǎn)至PVDF膜，rNsp的兔抗血清1︰500稀釋后為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（Jackson Immuno Research）1∶3000稀釋后為二抗。

2 結(jié)果

2.1 nspA基因擴(kuò)增、克隆和測(cè)序結(jié)果

PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，525 bp處有nspA基因擴(kuò)增片段。T-A克隆重組質(zhì)粒pMD18-TnspA和亞克隆重組質(zhì)粒pET42anspA經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后可獲得預(yù)期的酶切圖譜（圖1）。克隆和亞克隆重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果nspA基因核苷酸和氨基酸序列與GenBank中登錄的相應(yīng)序列（AY157539.1）完全相同。

2.2 rNspA的表達(dá)和提純效果

SDS-PAGE結(jié)果顯示，目的重組融合蛋白rNspA表達(dá)量最高，可達(dá)細(xì)菌總蛋白的40.1%，Ni-NTA親和層析法提純后rNspA顯示為單一的蛋白條帶（圖2）。

2.3 目的重組蛋白免疫原性檢測(cè)結(jié)果

rNspA兔抗血清免疫雙擴(kuò)效價(jià)為1∶4。Western blot結(jié)果表明，rNspA兔抗血清能有效識(shí)別rNspA并與之結(jié)合（圖2）。

3 討論

人類是淋病奈瑟菌唯一的自然宿主，主要通過性接觸傳播，淋病奈瑟菌引起的淋病是我國最常見性病之一。淋病奈瑟菌侵襲患者泌尿生殖系統(tǒng)，感染后出現(xiàn)尿道炎和宮頸炎以及附睪炎、盆腔炎等并發(fā)癥，女性患者還可由于并發(fā)癥造成不育、宮外孕等嚴(yán)重后果[4-6]。解放前我國淋病流行十分嚴(yán)重，經(jīng)綜合治理到二十世紀(jì)六十年代中期，淋病在我國已基本消滅，但八十年代后隨著改革開放淋病又重新傳入我國，到了二十世紀(jì)末，淋病發(fā)病率位居我國性病之首，隨著抗生素廣泛應(yīng)用，2000年后淋病的發(fā)病率雖有下降，但總體數(shù)量仍然龐大，淋病感染不容忽視[5，6]。根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心公布的甲、乙類傳染病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2009年和2010年我國淋病患者數(shù)分別為105 544人和119 824人。且由于臨床藥物使用混亂、劑量不足、療程不規(guī)范及部分患者在無任何指征情況下自行隨意用藥等，導(dǎo)致淋病奈瑟菌的耐藥性日趨增強(qiáng)，給淋病治療帶來了困難[4]。淋病發(fā)病率高和淋病奈瑟菌耐藥性強(qiáng)是擺在世界各國衛(wèi)生部門亟待解決的難題。各國都在尋找淋病新的治療和預(yù)防方法，疫苗成為研究的熱點(diǎn)。目前研究較多的候選疫苗，如Por、Pil、Opa、Los等[3]。但研究發(fā)現(xiàn)上述候選疫苗的抗原都存在不同程度的變異容易產(chǎn)生免疫逃逸。文獻(xiàn)報(bào)道淋病奈瑟菌nspA基因編碼的NspA氨基酸序列同源性高達(dá)98%，與腦膜炎奈瑟菌的同源性也達(dá)93%，說明該序列非常保守，是一個(gè)很好的疫苗候選者[3]。

我們根據(jù)GenBank公布的淋病奈瑟菌WHO-A株nspA基因序列設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行克隆、表達(dá)，構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli BL21pET42a-nspA在37℃ 1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下重組蛋白rNspA表達(dá)量可達(dá)細(xì)菌總蛋白量40.1%，即使在較低濃度的誘導(dǎo)劑（0.1 mmol/L的IPTG）作用下rNspA的量可達(dá)細(xì)菌總蛋白量的35%以上，并且主要以包涵體形式存在，這有利于產(chǎn)業(yè)化。Western bolt結(jié)果證實(shí)，rNspA兔抗血清與rNspA結(jié)合能有效識(shí)別，說明rNspA具有被抗體識(shí)別的抗原決定簇，具有良好的免疫反應(yīng)性。免疫雙擴(kuò)效價(jià)為1∶4，說明rNspA免疫家兔后能產(chǎn)生高效價(jià)抗體，具有良好的抗原性。

綜上所述，我們已成功建立了rNspA高效表達(dá)系統(tǒng)，所表達(dá)的rNspA有良好的免疫原性，可作為基因工程疫苗的候選抗原。

[參考文獻(xiàn)]

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（收稿日期：2011-11-08）