大鼠腦血腫周圍Caspase-3的表達與神經細胞凋亡的關系

[摘要] 目的 研究大鼠腦血腫周圍腦組織Caspase-3的表達和神經細胞凋亡及探討二者之間的關系。 方法 60只Wistar大鼠隨機分為假手術組（30只）和出血組（30只）。采用大鼠自體股動脈血注入尾殼核建立腦出血模型，分別于術后6、12、24、48、96 h 5個時間點取腦，應用免疫組化方法檢測血腫周圍組織Caspase-3的表達，TUNEL法檢測血腫周圍神經細胞凋亡。 結果 出血組大鼠腦血腫周圍組織Caspase-3的表達及細胞凋亡明顯高于假手術組（P ＜ 0.01），Caspase-3的表達與血腫周圍神經細胞凋亡呈正相關性（r = 0.956，P ＜ 0.05）。 結論 Caspase-3、神經細胞凋亡參與了大鼠腦血腫周圍腦組織損傷的病理過程。

[關鍵詞] 腦出血；Caspase-3；神經細胞凋亡

[中圖分類號] R743.34 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2012）03-0011-02

The association between expression of Caspase-3 and neuron apoptosis in perifocal tissue of intracerebral hemorrhage in rats

LI Jianshe1 BAI Hongying2

1.The Second Cadre Ward， Xinxiang Central Hospital， Xinxiang 453000， China; 2.Department of Neurology， the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450014， China

[Abstract] Objective To research the expression of Caspase-3 in perifocal tissue of intracerebral hemorrhage (ICH) and investigate the association between Caspase-3 and neuron apoptosis in perifocal tissue of ICH. Methods Sixty wistar rats were randomly divided into ICH group (n = 30) and sham operated group (n = 30). ICH rat models were prepared with injection of autologous blood into the right caudate nucleus. Each group was randomly divided into 5 various stages: 6 h， 12 h， 24 h， 48 h and 96 h. The expression of Caspase-3 was measured with immunohistochemistry method. Apoptosis was characterized by terminal deoxynucleotide transferase mediated uridine 5-triphosphate-biotin nick end-labeling (TUNEL) staining. Results Protein expression of Caspase-3 and neuron apoptosis of ICH group was higher than sham operated group (P ＜ 0.01). The association between Caspase-3 and neuron apoptosis in perifocal tissue of ICH was positively relative (P ＜ 0.05). Conclusion Caspase-3 and apoptosis are involved in pathophysiologic process of ICH.

[Key words] Intracerebral hemorrhage; Caspase-3; Neuron apoptosis

凋亡與中樞神經系統的正常發育、再生、增殖、病理變性密切相關。Caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵酶，在死亡受體通路、內質網通路和線粒體通路等多條細胞凋亡通路中發揮著重要的作用，是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必需物質[1]。本研究利用自體血注射造大鼠腦出血模型，采用免疫組織化學染色和TUNEL法來研究Caspase-3在血腫周圍的表達及其與血腫周圍神經細胞凋亡的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取60只成年Wistar大鼠，體重（240±20）g，由鄭州大學實驗動物中心提供。將實驗動物按隨機化的原則分為假手術組和出血組各30只。每組分為6、12、24、48、96 h 5個亞組。每個亞組6只。

1.2 主要試劑

TUNEL試劑盒（Sigma公司），兔抗Caspase-3多克隆抗體、SP系列二抗、DAB顯色液（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 大鼠尾狀核腦出血模型的建立

參照Xue M等[2]的方法，大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，頭頂正中縱行切口，鈍性分離暴露前囟，在前囟前0.2 mm、中線向左旁3.5 mm處，用牙科鉆頭鉆一直徑為1.0 mm的小孔，微量注射器由該孔垂直刺入5.0 mm，至尾狀核位置，出血組大鼠被注入自體股動脈血50 μL，假手術組注入0.9%氯化鈉注射液50 μL，縫合消毒皮膚。

1.4 標本及病理切片的制作

各組大鼠在相應的時間點用水合氯醛（600 mg/kg）深度麻醉，剖開胸腔，從左心室輸注0.9%氯化鈉注射液約300 mL，4%福爾馬林液150 mL，斷頭取腦，標本浸于4%福爾馬林液中固定24 h，以針眼為中心取厚約1 cm的冠狀切片，石蠟包埋、切片，片厚2 μm，進行Caspase-3免疫組化和TUNEL染色。

1.5 圖像采集分析

光鏡下，Caspase-3陽性神經細胞呈棕黃色或褐色，在400倍視野下，每張切片選取6個視野，利用Leica顯微照像系統和BDIS圖像分析軟件，計算Caspase-3陽性細胞的平均積分光密度值。凋亡指數計算：凋亡神經細胞核染色質邊集，細胞核內可見黃色或棕褐色顆粒。在400倍視野下隨機計數血腫周圍4個視野內的神經細胞及凋亡陽性細胞，凋亡指數=凋亡陽性細胞/神經細胞×100%。

1.6 統計學處理

所得數據以均數±標準差（x±s）表示，采用SPSS 11.0軟件對數據進行統計分析，兩組同一時間點均數間的比較采用t檢驗，多組均數間比較采用單因素方差分析，Caspase-3與TUNEL的相關性采用直線相關分析，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦血腫周圍Caspase-3的表達

假手術組尾狀核組織可見Caspase-3表達，表達水平很低，各時點表達水平的差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。出血組腦血腫周圍組織Caspase-3有較強的表達，6 h表達開始升高，24 h Caspase-3表達水平達到峰值，96 h仍有表達，多組間陽性細胞的平均積分光密度值比較差異有統計學意義（P ＜ 0.01）；出血組與假手術組同一時間點Caspase-3的表達水平比較，差異有統計學意義（P ＜ 0.01）。見表1。

2.2 原位末端標記法染色

光學顯微鏡下凋亡細胞的染色質集聚于細胞核內，靠近核膜，假手術組僅見極少量凋亡神經細胞。出血組凋亡神經細胞主要分布于血腫周邊，6 h凋亡細胞即增多，48 h神經細胞凋亡達峰值，96 h神經細胞凋亡減少，多亞組間凋亡指數比較，差異有統計學意義（P ＜ 0.01）。出血組與假手術組之間同一時間點凋亡指數比較，差異有統計學意義（P ＜ 0.01）。見表2。

2.3 血腫周圍細胞凋亡與Caspase-3表達的相關性

凋亡指數與前一時間點Caspase-3的表達呈正相關（r = 0.956，P ＜ 0.05）。見表3。

3 討論

正常細胞中Caspase-3以酶原Procaspase-3形式存在，在多種蛋白水解酶的催化作用下，Procaspase-3發生裂解而活化[3]。本研究顯示：出血組Caspase-3的表達主要分布于腦血腫周圍，表達從6 h開始逐漸增高，24 h達峰，4 d時表達明顯減少，24 h與12 h相比差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。同時點出血組與假手術組Caspase-3的表達比較差異有統計學意義（P ＜ 0.01）。此結果與吳家冪等[4]的研究結果相似，提示腦出血激發了血腫周圍腦組織Caspase-3的表達。

血腫周圍腦組織Caspase-3的表達的機制可能有以下方面：①已有研究證實腦血腫周圍Fas（自殺相關因子）高表達[5]，Fas在胞內與Fas死亡結構域鏈接蛋白（FADD）和Procaspase-8共同組成死亡信號復合體（DISC）使Procaspase-8發生自身催化，Caspase-8隨后激活Caspase-3；②腦出血后產生自由基、乳酸中毒和Ca2+內流增加導致線粒體內大量細胞色素C釋放入細胞漿，在三磷酸腺苷存在的條件下細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1結合，再結合Caspase-9前體并激活Caspase-9，進而激活Caspase-3；③Caspase-3酶原也能聚集和自我活化[6]。

本研究顯示出血組凋亡細胞主要分布于血腫周邊區，遠離血腫的腦組織凋亡細胞逐漸減少。6 h開始逐漸增高，48 h達峰，96 h凋亡細胞有所減少，但仍維持在較高水平，各時間點凋亡指數差異有統計學意義（P ＜ 0.01）。本研究顯示，凋亡的神經細胞與Caspase-3的表達在空間上具有一致性，主要分布于血腫周邊區的腦組織，提示Caspase-3參與了腦出血血腫周圍神經細胞的凋亡。細胞凋亡主要涉及了Fas介導的死亡受體途徑，活化的Fas通過形成死亡信號復合體，活化Caspase-3，繼而裂解ICAD而釋放CAD，CAD降解胞核內的染色體DNA[7]，致使血腫周圍神經細胞凋亡。另外Fas介導的死亡受體途徑中活化的Caspase-8也可啟動細胞凋亡的線粒體路徑，活化Caspase-3，進而致神經細胞凋亡。腦出血后血腫周圍神經細胞鈣內流超載，細胞內外鈣離子失衡，啟動細胞凋亡的內質網路徑，活化Caspase-12，進而活化Caspase-3，引發神經細胞凋亡[8]。因此腦出血后神經細胞凋亡可能是通過Fas介導的死亡受體路徑、線粒體路徑和內質網路徑共同完成的，這三個路徑的交聯點為Caspase-3，印證了Caspase-3為細胞凋亡過程中的關鍵酶的觀點。

qCaspase-3的高表達時間早于細胞凋亡的出現，細胞凋亡過程可能是抑凋亡基因、促凋亡基因、細胞因子間相互作用，此復雜過程需要能量，需要合成核糖核酸、蛋白質等，所以，從凋亡的啟動到典型的凋亡形態的出現需數小時或數天不等。以上結果表明血腫周圍神經凋亡與Caspase-3的表達具有相關性，Caspase-3、凋亡參與了大鼠腦血腫周圍腦組織損傷的病理生理過程。

[參考文獻]

[1] Yuan J，Yankner BA. Apoptosis in the nervous system[J]. Nature，2000，407（6805）：802-809.

[2] Xue M，Del Bigio MR. Intracerebral injection of autologous whole blood in rats：time course of inflammation and cell death[J]. Neurosci 1ett，2000，283（3）：230-232.

[3] 俞虎，劉偉國. Caspase-3與創傷性腦損傷[J]. 國際神經病學神經外科學雜志，2005，32（4）：377-380.

[4] 吳家冪，李珺. Caspase-3在腦出血后神經細胞凋亡中的作用[J]. 放射免疫學雜志，2005，18（2）：135-137.

[5] 李建設，白宏英，王金蘭，等. 大鼠腦出血后Fas表達與神經細胞凋亡的關系及氟桂利嗪的干預作用[J]. 中國實用神經疾病雜志，2009，12（3）：35-38.

[6] Elmore S. Apoptosis：a review of programmed cell death[J]. Toxicol Pathol，2007，35（4）：495-516.

[7] 許益笑，王萬鐵. 肺缺血再灌注時細胞凋亡及基因調控研究進展[J]. 中國微循環，2008，12（4）：252-255.

[8] 李玲，陳康寧，陳復明，等. 氟桂利嗪干預后腦出血大鼠血腫周圍神經元凋亡的變化[J]. 中國臨床康復，2005，9（45）：40-42.

（收稿日期：2011-11-24）