釀酒酵母的乳酸抗性機制

摘要：以釀酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）乳酸抗性單倍體突變株Ｔ－２７－２４（α ｔｒｐ－ ｕｒａ－）和其親株Ｔ－２７（α ｔｒｐ－ ｕｒａ－）為研究對象，考察于３０℃在５％（Ｖ／Ｖ，下同）乳酸沖擊條件下菌體存活率、細胞膜通透性以及菌體積累海藻糖和麥角固醇等方面的情況。結果表明，在５％乳酸沖擊下，Ｔ－２７－２４菌體存活率明顯高于Ｔ－２７，且比Ｔ－２７具有較強的降低細胞受沖擊時細胞膜通透性的作用；同時Ｔ－２７－２４對海藻糖和麥角固醇的積累能力都明顯高于Ｔ－２７。因此，Ｔ－２７－２４具有較強的維持細胞膜完整性和積累海藻糖及麥角固醇的能力，這是其具有乳酸抗性的重要原因。

關鍵詞：釀酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；乳酸抗性；細胞膜通透性

中圖分類號：ＴＱ９２６．１；Ｑ９３５ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）02－0367-02

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ

ＣＨＥＮＧ Ｓｈｕ－ｍｅｉ１，２，ＬＩ Ｈｕｉ－ｙｉｎｇ２，ＧＵ Ｊｉｎ－ｌａｎ１，ＷＡＮＧ Ｃｈａｎｇ－ｌｕ１

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｑｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００0２２，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ， Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１０００，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ａ ｈａｐｌｏｉｄ ｍｕｔａｎｔ Ｔ－２７－２４（α ｔｒｐ－ ｕｒａ－） ａｎｄ Ｔ－２７（α ｔｒｐ－ ｕｒａ－） ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈａｌｌｉ， ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ tｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ａｎｄ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ５％（Ｖ／Ｖ） ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ａｔ ３０℃． Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ Ｔ－２７－２４ ｔｈａｌｌｉ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈｅｒ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌular membrane ｔｈａｎ Ｔ－２７； Aｌｓｏ Ｔ－２７－２４ ｃｏｕｌｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ ｍｏｒｅ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ａｎｄ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ ｔｈａｎ Ｔ－２７． Ｉｎ ａ ｗｏｒｄ， ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ａｎｄ ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ａ ｌｏｔ ｔｏ ｔｈｅ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｔ－２７－２４．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ； ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ； ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌular membrane

酵母菌是一種單細胞低等真核生物，是人類應用最早的微生物，特別是釀酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）的工業應用比較廣泛。目前對釀酒酵母耐酒精［１］、耐滲透壓機理的研究已經比較深入，但對于釀酒酵母抗酸的機理研究，特別是抗性與其細胞膜的完整性以及細胞在惡劣環境中對一些特殊物質的積累（例如海藻糖和麥角固醇）之間的關系的研究尚未見報道。

在利用酵母菌的發酵工業中，大多數采用純種進行發酵，通常采用嗜殺酵母或添加有機酸的方法來抑制雜菌［２］。因此將抗酸酵母應用于酸度較高的葡萄汁中進行葡萄酒發酵等具有重要意義。

通過研究釀酒酵母乳酸抗性產生與細胞膜通透性及海藻糖和麥角固醇積累能力的關系，對完善酵母乳酸抗性機理具有重要意義。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 菌種 Ｔ－２７（α ｔｒｐ－ ｕｒａ－）由天津科技大學食品生物技術研究室保藏。Ｔ－２７－２４（α ｔｒｐ－ ｕｒａ－）是由Ｔ－２７誘變得到的乳酸抗性酵母單倍體突變株。

１．１．２ 培養基 ＹＰＤ培養基：酵母膏１ g/L，蛋白胨２ g/L，葡萄糖２ g/L，ｐＨ ６．０。培養基滅菌條件為１２１ ℃滅菌２０ ｍｉｎ。

１．２ 方法

１．２．１ 高濃度乳酸沖擊下菌體存活率的測定方法 為研究高濃度乳酸沖擊下菌體的生長情況，將在１００ ｍＬ ＹＰＤ培養基中培養到對數生長期的Ｔ－２７及Ｔ－２７－２４發酵液進行離心、洗滌、收集菌體，轉移至１００ ｍＬ ５％（Ｖ／Ｖ，下同）乳酸溶液中，搖床條件下（２２０ ｒ／ｍｉｎ）進行沖擊，定期取樣，按照稀釋平板法做活菌記數，計算菌體存活率。

１．２．２ 細胞膜通透性的測定方法 由于細胞膜上沒有運載核苷酸的載體，因此可以通過測定胞外核苷酸濃度研究細胞膜的通透性［３］。將在１００ ｍＬ ＹＰＤ培養基中培養至對數生長期的Ｔ－２７和Ｔ－２７－２４發酵液進行離心，去離子水洗滌，直至上清液在２６０ ｎｍ處的光吸收可以忽略為止，將菌體轉移至１００ ｍＬ ５％乳酸溶液中，３０ ℃進行搖床培養。定期檢測溶液在２６０、２８０ ｎｍ處的吸光度，直至兩者都達到平衡值。胞外核苷酸濃度＝１１．８７×Ａ２６０ ｎｍ-１０．４０×Ａ２８０ ｎｍ，核苷酸濃度以每毫升溶液含磷的微克數來表示。

１．２．３ 細胞海藻糖和麥角固醇含量的測定方法 海藻糖含量測定參考文獻［４］方法進行，麥角固醇含量測定參考文獻［５］方法進行。

２ 結果與分析

２．１ 高濃度乳酸沖擊下菌體存活率的測定結果

Ｔ－２７和Ｔ－２７－２４于３０℃在５％乳酸溶液中進行沖擊，其菌體存活率如圖１所示。由圖１可知，在5%乳酸沖擊９０ ｈ時Ｔ－２７的存活率為０，而Ｔ－２７－２４的存活率為４６％，表明乳酸抗性單倍體突變株Ｔ－２７－２４對5%乳酸的抵抗力明顯高于出發菌株Ｔ－２７。為進一步探討突變株對5%乳酸的抗性與細胞膜特性的相關性，進一步對Ｔ－２７和Ｔ－２７－２４的細胞膜通透性進行研究。

２．２ 細胞膜通透性的測定結果

Ｔ－２７和Ｔ－２７－２４于３０℃在５％乳酸沖擊下胞外核苷酸濃度的變化如圖２所示。圖２顯示了Ｔ－２７和Ｔ－２７－２４在５％乳酸沖擊下胞內核苷酸通過細胞膜的擴散進程，從圖２中可以看出，乳酸抗性單倍體突變株Ｔ－２７－２４與其出發菌株Ｔ－２７相比，在相同沖擊時間內胞內核苷酸的擴散進程明顯降低，證明在５％乳酸沖擊下，乳酸抗性單倍體突變株Ｔ－２７－２４具有較強的降低菌體受沖擊時細胞膜通透性的作用，即具有較強的增強膜滲透屏障的能力。

２．３ 細胞海藻糖和麥角固醇含量的測定結果

鑒于海藻糖和麥角固醇在維持細胞膜的穩定性方面都具有重要作用［１］，為驗證其是否在釀酒酵母對乳酸抗性中具有作用，對Ｔ－２７和Ｔ－２７－２４在５％乳酸沖擊條件下進行檢測，結果分別如圖３和圖４所示。從圖３和圖４可以看出，于３０℃在５％乳酸沖擊條件下，乳酸抗性單倍體突變株Ｔ－２７－２４的海藻糖和麥角固醇的含量都明顯高于其出發菌株Ｔ－２７。由此可見，乳酸抗性單倍體突變株Ｔ－２７－２４在積累海藻糖和麥角固醇方面具有明顯的優勢，其在保持菌株于惡劣環境中維持細胞膜的完整性方面具有重要作用。

３ 討論

目前，已知海藻糖、麥角固醇在惡劣條件下具有保持蛋白質、核酸等大分子物質的結構和功能不受破壞的特異功效，但對菌體在惡劣條件下對細胞膜通透性的影響還未見報道。以上研究證明，乳酸抗性單倍體突變株Ｔ－２７－２４在維持細胞膜的完整性和積累海藻糖、麥角固醇方面具有較強能力，這是其對乳酸抗性的重要原因。

參考文獻：

［１］ 池振明，高 峻． 酵母菌耐酒精機制的研究進展［Ｊ］． 微生物學通報，１９９９，２６（５）：３７３－３７６．

［２］ 王昌祿，杜連祥，顧曉波，等． 抗酸酵母遺傳特性的初步研究［Ｊ］． 微生物學通報，１９９８，２５（４）：２１３－２１７．

［３］ ＭＩＺＯＧＵＣＨＩ Ｈ，ＨＡＲＡ Ｓ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒｓ ｏｎ ｓｉｍｐｌｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ａｔ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｊ Ｆｅｒｍｅｎｔ Ｂｉｏｅｎｇ，１９９６，８１（５）：４０６－４１１．

［４］ 張 巖，梁 盟，劉德華． 克魯氏假絲酵母在高滲環境中海藻糖和胞內甘油積累的研究［Ｊ］． 生物工程學報，２００１，１７（３）：３３３－３３４．

［５］ 張博潤，何秀萍，鐵翠娟，等． 麥角固醇高產菌株的構建及其培養優化條件的研究［Ｊ］． 生物工程學報，１９９９，１５（１）：４６－５１．