卷丹的原球莖誘導及植株再生

摘要：以卷丹（Ｌｉｌｉｕｍ ｌａｎｃｉｆｏｌｉｕｍ）的鱗莖、葉片和珠芽為外植體，建立了卷丹快速繁殖的植株再生體系，探討了不同外植體、培養(yǎng)基對卷丹原球莖誘導、分化的影響。結(jié)果表明，鱗莖是最適合誘導原球莖的外植體，誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為ＭＳ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ；誘導原球莖的最佳培養(yǎng)基為ＭＳ＋０．５０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ；較適合原球莖出芽的培養(yǎng)基為ＭＳ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，較適合不定芽生根的培養(yǎng)基為ＭＳ＋０．５０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ。

關鍵詞：卷丹；原球莖；誘導；植株再生

中圖分類號：Ｓ６８２．２＋９；Ｑ９４３．１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）02－0396-03

Research on Inducement of Lilium lancifolium Protocorm and Plant Regeneration

HE Wei1，ＪＩＮＧ Ｄａｎ－ｌｏｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｑｉａｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｊｉｎｇ２，ＺＨＡＮＧ Ｄｅ－ｃｈｕｎ１

（1. Biotechnology Research Center of China Three Gorges University， Yichang 443002， Hubei， China;

2. Biodiversity Conservation Research Laboratory， Hubei Shennongjia National Nature Reserve Administration， Muyu 442400， Hubei， China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｌｉｌｉｕｍ ｌａｎｃｉｆｏｌｉｕｍ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｕｓｉｎｇ ｂｕｌｂｓ， ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｂｕｌｂｉｌｓ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｂｕｌｂ ｗａｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｐｌａｎｔ ｆｏｒ ｐｒｏｔｏｃｏｒｍ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｕｌｂ ｗａｓ ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ｐｒｏｔｏｃｏｒｍ ｗａｓ ＭＳ＋０．５ ｍｇ/Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ/Ｌ ＮＡＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｂｕｄｄｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ｐｒｏｔｏｃｏｒｍ ｗａｓ ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ； Aｎｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｒｏｏｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ｇｅｍｍａ ｗａｓ ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｉｌｉｕｍ ｌａｎｃｉｆｏｌｉｕｍ； ｐｒｏｔｏｃｏｒｍ； ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ； ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

卷丹（Ｌｉｌｉｕｍ ｌａｎｃｉｆｏｌｉｕｍ），又稱虎皮百合、宜興百合，是百合科百合屬多年生草本植物，多生長于海拔４００～２ ５００ ｍ的山坡灌木林下、草地、路邊或水旁，分布于江蘇、湖北等１７個省區(qū)，在日本、朝鮮也有分布。其鱗莖含有大量的淀粉和蛋白質(zhì)，具有很高的食用價值和藥用價值［１］。卷丹花型奇特，因其花瓣向外翻卷，花色火紅，故有“卷丹”之美名。它不僅適用于園林中花壇及庭院栽植，也是切花和盆栽的良好材料，已成為國內(nèi)外重要觀賞花卉之一。

傳統(tǒng)的卷丹繁殖方法主要是分球和分珠芽法，不僅繁殖系數(shù)低、周期長，而且存在多代繁殖后品性退化的現(xiàn)象。因此，建立一種高效、快捷的卷丹繁殖方法，對于合理保護和利用卷丹資源具有十分重要的意義。目前，國內(nèi)外對卷丹的組培報道局限于通過外植體誘導不定芽并分化產(chǎn)生植株［２，３］，通過原球莖發(fā)生途徑迅速大量繁殖卷丹的報道很少。本試驗建立了穩(wěn)定的卷丹原球莖誘導體系，并通過分化產(chǎn)生完整植株，對有效、合理地保護和利用卷丹資源具有一定的意義。

１ 材料與方法

１．１ 材料

卷丹于２０１０年７月采自湖北省長陽土家族自治縣，外植體為卷丹植株（生長健壯、無病蟲害）的鱗莖、葉片和珠芽。將上述３種外植體分別放于干凈燒杯中，在含洗潔凈的去離子水中浸泡５～１０ ｍｉｎ，用軟毛刷輕輕刷洗，自來水沖洗２ ｈ，分別采取如下方法對３種外植體滅菌：①鱗莖用體積分數(shù)為７５％的乙醇溶液滅菌２５ｓ，無菌水清洗３次，再用1.0 mg/L HgCl2溶液滅菌７ ｍｉｎ，無菌水清洗５次；②葉片用７５％乙醇溶液滅菌２０ ｓ，無菌水清洗３次，再用1.0 mg/L HgCl2溶液滅菌６ ｍｉｎ，無菌水清洗５次；③珠芽用７５％乙醇溶液滅菌２５ ｓ，無菌水清洗３次，再用1.0 mg/L HgCl2溶液滅菌８ ｍｉｎ，無菌水清洗５次。

１．２ 方法

取無菌鱗莖和葉片，在無菌濾紙上將其切成１ ｃｍ×１ ｃｍ左右的小塊，取珠芽剝?nèi)ネ獍謩e接種于ＭＳ培養(yǎng)基添加６－ＢＡ（１．００、２．００ ｍｇ／Ｌ）和ＮＡＡ（０．５０、１．００和２．００ ｍｇ／Ｌ）不同組合的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。每瓶接種５個外植體，每種培養(yǎng)基設置５個重復。每１５ ｄ轉(zhuǎn)到相同培養(yǎng)基上繼代，繼代２次后，將愈傷組織轉(zhuǎn)接到ＭＳ培養(yǎng)基添加６－ＢＡ（０．０５、０．５０、１．００、１．５０ ｍｇ／Ｌ）、ＮＡＡ（０．１０、０．２０和０．５０ ｍｇ／Ｌ）和２，４－Ｄ（１．００ ｍｇ／Ｌ）不同組合的原球莖誘導培養(yǎng)基上（表１），誘導原球莖。

將誘導產(chǎn)生的原球莖接種到芽分化培養(yǎng)基（表２）上，每種培養(yǎng)基上接種１０團原球莖，觀察比較不同培養(yǎng)基對卷丹原球莖誘導不定芽的影響，并統(tǒng)計各組的誘導率；待誘導產(chǎn)生的不定芽長到２～３ ｃｍ時，將芽接種到生根培養(yǎng)基（表３）中，誘導生根，觀察比較不同培養(yǎng)基對不定芽生根的影響，統(tǒng)計各組的生根率。外植體原球莖誘導率＝誘導形成原球莖的外植體數(shù)／總外植體數(shù)×１００％；不定芽誘導率＝誘導形成不定芽的原球莖數(shù)／接種的原球莖數(shù)×１００％；生根率＝誘導生根的不定芽數(shù)／接種的不定芽數(shù)×１００％；若不做特殊說明，培養(yǎng)基添加蔗糖３0 g/L、瓊脂８ g/L。培養(yǎng)溫度（２５±２）℃，光照度２ ０００ ｌｘ，光照時間１６ ｈ／ｄ，ｐＨ ５．８０～６．００，１２１℃滅菌２０ ｍｉｎ。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 不同外植體對原球莖誘導的影響

試驗中卷丹鱗莖、珠芽、葉片３種外植體接種后生長情況差異明顯。鱗莖接種７ ｄ后，切口處開始長出淡黃綠色的愈傷組織，部分鱗莖外植體出現(xiàn)輕微褐化，而后愈傷組織漸多；珠芽接種１４ ｄ后，開始萌動，但未見愈傷組織，最終全部發(fā)育為叢芽（圖１D）；而葉片接種２ ｄ后即逐漸開始褐化，７ ｄ后基本全部褐化，無愈傷組織產(chǎn)生。由此可見，鱗莖較適合作為卷丹原球莖誘導的外植體。

２．２ 不同培養(yǎng)基對原球莖誘導的影響

在鱗莖誘導原球莖的試驗組中，接種７ ｄ后明顯可見在切口處長出瘤狀突出、大小不等的愈傷組織。隨培養(yǎng)時間的延長，外植體上的愈傷組織數(shù)量增多，其中在培養(yǎng)基ＭＳ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ上的誘導率最高，平均每個鱗莖上長出１１個愈傷組織。

經(jīng)切割后將愈傷組織轉(zhuǎn)接到原球莖誘導培養(yǎng)基上，２次繼代，逐漸長出淡黃色、顆粒狀的原球莖（圖１A）。由表１的結(jié)果可以看出，培養(yǎng)基ＭＳ＋０．５０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ的誘導率最高，其愈傷組織的生長狀況明顯優(yōu)于其他組合。綜合分析培養(yǎng)基的激素組合可以看出，在由愈傷組織誘導原球莖的過程中，６－ＢＡ在其中起主要作用，６－ＢＡ含量過高或過低都對原球莖的誘導不利，較為合適的濃度為０．５０ ｍｇ／Ｌ。

２．３ 不同培養(yǎng)基對卷丹分化的影響

２．３．１ 激素對原球莖誘導不定芽的影響 將原球莖轉(zhuǎn)接到不定芽誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)１４ ｄ，可見原球莖頂部開始突出、變綠，再經(jīng)過５ ｄ培養(yǎng)，長出肉眼可見的小芽，最終發(fā)育成不定芽（圖１Ｂ）。不定芽簇生，每團原球莖長出的不定芽數(shù)量也存在差異，４２ ｄ后不定芽誘導結(jié)果見表２。由表２可以看出，培養(yǎng)基ＭＳ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ的誘導率最高，培養(yǎng)基ＭＳ＋０．０５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ的誘導率次之。這兩者的ＮＡＡ濃度均為０．１０ ｍｇ／Ｌ，是組合中最低濃度。這說明，低濃度的ＮＡＡ有利于卷丹不定芽的誘導，而兩者的６－ＢＡ濃度相差１９倍，說明在一定范圍內(nèi)，適當高濃度的６－ＢＡ有利于卷丹不定芽的產(chǎn)生。同時后者添加了２，４－Ｄ，前者未添加，兩者的誘導率均較高；添加了２，４－Ｄ的培養(yǎng)基中，除ＭＳ＋０．０５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ外，其余誘導率都很低，這可能與該培養(yǎng)基中添加的較低濃度的ＮＡＡ和６－ＢＡ有關。

２．３．２ 激素對根誘導的影響 誘導產(chǎn)生的不定芽在生根培養(yǎng)基上經(jīng)過２１ ｄ的培養(yǎng)，長出數(shù)量不等的不定根（圖１Ｃ），４０ ｄ后誘導結(jié)果見表３。培養(yǎng)基ＭＳ＋０．５０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ中芽體生根率最高，且長出的不定根比其他培養(yǎng)基中長出的粗壯且根毛多。此外，培養(yǎng)基ＭＳ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ次之，其長出的根也較粗壯。而其余３種培養(yǎng)基，生根率相對較低，但不定芽基部都明顯膨大，又重新產(chǎn)生大量愈傷組織。由此可見，低濃度的ＮＡＡ有利于卷丹不定芽的生根，而６－ＢＡ對生根不利，甚至可能產(chǎn)生抑制作用。

２．４ 生根和移栽

生根３０ ｄ后，將封口膜打開，煉苗７ ｄ，使其適應外界的溫度、光照度和濕度。選取根長為５ ｃｍ左右且株高１０ ｃｍ以上的幼苗移栽至已滅菌的基質(zhì)（河沙∶椰絨∶珍珠巖＝１∶１∶１，Ｖ∶Ｖ∶Ｖ）中，以１／２ＭＳ為營養(yǎng)液噴灑幼苗后，用燒杯罩住以保溫保濕，４周左右便可見到葉片和根明顯增長，新葉萌發(fā)，移栽１個月后統(tǒng)計，成活率達８０％。

３ 小結(jié)與討論

試驗結(jié)果表明，鱗莖較適合作為卷丹原球莖誘導的外植體。原球莖誘導的最適培養(yǎng)基為ＭＳ＋０．５０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ；誘導原球莖分化成不定芽的最適培養(yǎng)基為ＭＳ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ；最適生根的培養(yǎng)基為ＭＳ＋０．５０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ。卷丹的再生植株移栽后成活率高達８０％。

不同的外植體在組織培養(yǎng)過程中存在差異。在百合的組織培養(yǎng)中，多采用鱗莖作為外植體，本試驗采用了３種卷丹外植體（鱗莖、葉片和珠芽）和不同激素組合，對影響卷丹組織培養(yǎng)的因素進行了探討。結(jié)果表明，卷丹不同外植體的原球莖誘導率為鱗莖﹥珠芽﹥?nèi)~片。在誘導過程中，卷丹鱗莖接種后經(jīng)過數(shù)次繼代即可發(fā)育成原球莖。珠芽雖愈傷組織誘導率較低，但在生芽方面卻表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。這與付娜等［４］在龍牙百合珠芽組培中所得出的結(jié)果一致。由于卷丹珠芽的數(shù)量遠多于其他百合，采集方便，且珠芽著生在植株的地上部分，外表堅硬，所攜帶菌量較少，不易受到損傷，污染率較低，在繼代培養(yǎng)時很少出現(xiàn)內(nèi)生細菌滋生的現(xiàn)象［５］，也是比較理想的組培快繁外植體。葉片接種后，２ ｄ后開始出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，不久完全褐化。這說明卷丹葉片不適合作為組織培養(yǎng)的外植體，這也是目前很少看到以卷丹葉片為外植體進行組織培養(yǎng)的主要原因。

在卷丹原球莖的誘導及分化過程中，外源激素的種類和濃度發(fā)揮重要作用。在愈傷組織誘導過程中，適當濃度的６－ＢＡ和ＮＡＡ有重要作用。這與葛蓓孛等［６］在細葉百合組織培養(yǎng)中的結(jié)果基本一致，只是使用濃度稍有差別，這可能是由于培養(yǎng)材料的差別所致。在卷丹愈傷組織誘導原球莖的過程中，６－ＢＡ的濃度對原球莖的誘導率有重要影響。本試驗表明，低濃度的ＮＡＡ和適當高濃度的６－ＢＡ組合使用有利于原球莖的出芽，這與段祖安等［７］的結(jié)果一致。低濃度的ＮＡＡ在不定芽生根過程中起著重要作用。

材料褐化是組培試驗和生產(chǎn)過程中常常會遇到的難題之一，而材料的褐化問題能否得到有效控制是影響試驗成敗的關鍵因素。目前，對于產(chǎn)生褐化的機理尚未得出統(tǒng)一的定論。朱文祥等［８］認為，從褐化產(chǎn)生途徑分析得出引起褐化是由材料、環(huán)境條件等多種因素共同作用的結(jié)果。在培養(yǎng)基中添加適當濃度的活性炭可以防止和延緩百合的褐化，促進原球莖的增殖和根的發(fā)育［９］。熊丹等［１０］在宜昌百合鱗莖組織培養(yǎng)中添加０．５％的活性炭能有效防止褐化。該試驗中，葉片因褐化嚴重最終均無任何愈傷組織產(chǎn)生，因此對于如何減輕和控制卷丹愈傷組織的褐化問題還有待進一步探討。

參考文獻：

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［２］ 段祖安，王洪利，趙艷燕，等． 卷丹百合組培快繁技術的研究［Ｊ］． 山東農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），２００９，４０（４）：４９５－４９７．

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［４］ 付 娜，白志川，劉世堯，等． 龍牙百合珠芽組織培養(yǎng)研究［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學，２０１０，３８（３４）：１９２５８－１９２５９．

［５］ 郭海濱，雷家軍．卷丹百合鱗片及珠芽組織培養(yǎng)研究［Ｊ］． 中國農(nóng)學通報，２００６，２２（２）：７２－７４．

［６］ 葛蓓孛，楊青杰，吳 萍，等． 細葉百合組織培養(yǎng)植株再生［Ｊ］． 東北林業(yè)大學學報，２０１０，３８（５）：５４－５９．

［７］ 段祖安，王洪利，趙艷燕，等． 卷丹百合組培快繁技術的研究［Ｊ］． 山東農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），２００９，４０（４）：４９５－４９７．

［８］ 朱文祥，王金榮，李 珺，等． 植物組織培養(yǎng)中外植體褐變研究進展［Ｊ］． 安徽農(nóng)業(yè)科學，２０１０，３８（３１）：１７３９９－１７４０１，１７４１５．

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［１０］ 熊 丹，陳發(fā)菊，梁宏偉，等． 宜昌百合的組織培養(yǎng)研究［Ｊ］． 福建林業(yè)科技，２００７，３４（４）：９１－９５．