八氫番茄紅素脫氫酶基因超表達載體的構建及表達鑒定

摘要：八氫番茄紅素脫氫酶（ＰＤＳ）是植物類胡蘿卜素生物合成途徑中促進番茄紅素合成的關鍵酶，根據番茄中該酶的編碼基因序列設計一對特異引物，通過ＲＴ－ＰＣＲ在番茄中擴增出一個約１ ９００ ｂｐ的全長ｃＤＮＡ片段。對這個全長片段構建了超表達載體，酶切檢測表明該片段已插入植物表達載體。采用農桿菌介導的方法轉化番茄獲得１0株轉基因植株，ＰＣＲ檢測表明外源基因已導入番茄基因組中。轉基因番茄果實的番茄紅素含量分析結果表明，轉基因后代株系番茄紅素平均含量比對照增加了１．4倍，ＰＤＳ編碼基因的超表達有效促進了番茄果實中番茄紅素的合成和積累。

關鍵詞：番茄；八氫番茄紅素脫氫酶；超表達；載體構建；遺傳轉化

中圖分類號：S641.2；Q78 文獻標識碼：B 文章編號：0439－８114（２０12）02－0393-04

Construction of Overexpression Vector for Phytoene Dehydrogenase Gene and Its Expression Identification in Tomato

ＺＯＵ Ｌｉ－ｐｉｎｇ，ＧＡＯ Ｈｅ－ｐｉｎｇ，ＺＨＯＮＧ Ｙａ－ｑｉｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉａｏｇａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｏｇａｎ ４３２０００，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （ＰＤＳ） ｉｓ ａ ｋｅｙ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ． Ａ １ ９００ ｂｐ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ｆｒｏｍ ｔｏｍａｔｏ ｕｓｉｎｇ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＰＤＳ． Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ， ｔｈｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｅｎｚｙｍｅｓ． Ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｔｏｍａｔｏ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ tｅｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＰＣＲ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｔｏｍａｔｏ ｇｅｎｏｍｅ． Ｔｈｅ ｌｙｃｏｐｅｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ ｗｅｒｅ １．4 ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ， ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＤＳ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅ ｌｙｃｏｐｅｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｍａｔｏ ｆｒｕｉｔｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｏｍａｔｏ； ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ； ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ

番茄紅素是一種天然植物色素，是許多類胡蘿卜素生物合成的中間體。番茄紅素廣泛存在于水果及蔬菜中，在番茄中的含量最高。

近年來國內外許多研究表明，番茄紅素可以猝滅活性氧類物質，清除體內自由基，活化免疫細胞，具有防癌、抗癌作用。番茄紅素能消除香煙和汽車廢氣中的有毒物質，可以預防和治療心腦血管疾病，保護皮膚。番茄紅素的抗氧化性能是天然類胡蘿卜素中最強的，其獨特的生理功能正越來越受到人們的重視［１］。

經過多年的研究，人們已基本清楚了植物類胡蘿卜素的生物合成途徑［２，３］，也克隆了合成途徑中的大多數關鍵酶基因［３－５］，這使得人們可以通過基因工程的方法調控番茄紅素的生物合成。在植物類胡蘿卜素的生物合成途徑中，八氫番茄紅素脫氫酶（ＰＤＳ）是促進番茄紅素合成的關鍵酶，該研究的目的是通過ＲＴ－ＰＣＲ的方法從番茄中克隆該關鍵酶基因，構建超表達載體并通過農桿菌介導對番茄進行遺傳轉化，以增加轉基因后代植株中的番茄紅素含量，提高番茄果實的營養價值。

１ 材料與方法

１．１ 材料

番茄品種中蔬５號、大腸桿菌ＤＨ５α、植物表達載體ｐＭＶ（由ｐＢＩ１２１改造而成，即將ＧＵＳ片段缺失，引入含有５′－ＸｂａⅠ－ＸｈｏⅠ－ＫｐｎⅠ－ＳａｃⅠ－３′多酶切克隆位點的片段）由華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室番茄組提供。ＴＲＩｚｏｌ試劑盒購自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，克隆載體質粒ｐＭＤ１８－Ｔ購自ＴａＫａＲａ公司，第一鏈ｃＤＮＡ合成試劑盒、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ ＤＮＡ連接酶、限制性內切酶購自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，ＤＮＡ純化回收試劑盒及其他相關試劑購自上海生工生物工程有限公司。

１．２ 方法

１．２．１ ＲＴ－ＰＣＲ擴增及基因克隆 根據ＧｅｎＢａｎｋ中番茄八氫番茄紅素脫氫酶（ＰＤＳ）編碼基因序列（Ｍ８８６８３）設計一對引物為Ｆ：５′－ＴＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣＣＣＡＡＣＣ－３′，Ｒ：５′－ＴＣＡＣＣＴＣＧＣＡＣＴＣＴＴＣＴＴ－３′。從番茄組織中抽提ＲＮＡ進行反轉錄，獲得ｃＤＮＡ第一鏈。以獲得的ｃＤＮＡ為模板進行ＲＴ－ＰＣＲ反應，反應體系為２５ μＬ，內含１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，ＭｇＣｌ２ １．５ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｄＮＴＰｓ ０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ，基因特異引物０．５ μｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶１Ｕ，模板約１００ ｎｇ。反應條件：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃、１ ｍｉｎ，５６ ℃、１ ｍｉｎ，７２ ℃、２ ｍｉｎ，３５個循環；最后７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。回收ＲＴ－ＰＣＲ擴增得到的ｃＤＮＡ片段，克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ載體上，方法見文獻［６］。重組克隆測序由上海英駿生物技術有限公司完成。

１．２．２ 超表達載體的構建 將含有ＰＤＳ編碼基因的ｐＭＤ１８－Ｔ載體用ＳａｌⅠ和ＫｐｎⅠ雙酶切，回收小片段克隆到經ＸｈｏⅠ和ＫｐｎⅠ雙酶切的ｐＭＶ載體上，構建成超表達載體（圖１）。將構建的載體通過電擊法導入根癌農桿菌ＥＨＡ１０５中。

１．２．３ 番茄的遺傳轉化 番茄的遺傳轉化參見文獻［７］。當卡那霉素抗性芽長到２～３ ｃｍ后切下抗性芽，插入到生根培養基中誘導生根。當根長到３～４ ｃｍ后將小植株開瓶煉苗３～５ ｄ，然后移栽到花盆中。

１．２．４ 轉基因植株的檢測及番茄紅素含量測定 提取卡那霉素抗性植株及未轉化植株的總ＤＮＡ，用ＮＰＴⅡ引物（Ｆ：５′－ＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴ－３′，Ｒ：５′－ＴＣＡＴＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴＣ－３′）進行ＰＣＲ檢測。ＰＣＲ反應體系和擴增程序見文獻［７］。轉基因植株及對照番茄紅素含量測定參照萬群等［８］介紹的方法。

２ 結果與分析

２．１ 番茄ＰＤＳ編碼基因的克隆

以番茄葉片第一鏈ｃＤＮＡ為模板，通過ＲＴ－ＰＣＲ擴增出一大小在１ ９００ ｂｐ左右的片段（圖２）。回收目的片段克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ載體上。重組質粒經ＳａｌⅠ與ＫｐｎⅠ雙酶切檢測，可切下一大小在１ ９００ ｂｐ左右的片段（圖３），證明克隆成功，命名為ｐＭＤＰＤＳ。重組子測序結果表明，所克隆的片段全長１ ９２７ ｂｐ，其序列與ＧｅｎＢａｎｋ中Ｍ８８６８３的序列完全一致。

２．２ 植物超表達載體的構建

選擇經測序驗證的正義重組克隆子ｐＭＤＰＤＳ，先用ＳａｌⅠ和ＫｐｎⅠ雙酶切，再與經ＸｈｏⅠ和ＫｐｎⅠ雙酶切后的ｐＭＶ載體連接，構建成超表達載體，定名為ｐＭＰＤＳ。ｐＭＰＤＳ經ＸｂａⅠ和ＫｐｎⅠ雙酶切檢測，可切下一大小在１ ９００ ｂｐ左右的片段（圖４），表明所構建的超表達載體完全正確。

２．３ 轉基因植株的獲得與檢測

采用農桿菌介導的共培養法獲得了１1株卡那霉素抗性再生植株，這些抗性植株與對照相比沒有明顯的形態學差異。以ｐＭＰＤＳ載體為陽性對照，未轉基因植株為陰性對照，利用ＮＰＴⅡ引物對卡那霉素抗性植株進行ＰＣＲ的檢測結果顯示，１0株再生植株能擴增出預期的７４０ ｂｐ的電泳帶，而未轉基因植株則無該特異帶（圖５），初步表明外源基因已整合到番茄的基因組中，ＰＣＲ結果陽性的植株占抗性植株的比例為９0．9％。

２．４ 轉基因植株后代番茄紅素含量分析

對轉基因番茄植株Ｔ１代株系測定果實番茄紅素含量，結果見圖６。從圖中可看出，轉基因植株果實番茄紅素含量都比對照顯著增加，最高的株系６比對照增加了２．１倍，平均增加了１．4倍。

３ 小結與討論

植物類胡蘿卜素生物合成途徑是重要的色素合成途徑，由于植物類胡蘿卜素合成途徑中幾乎所有的基因均已被分離和鑒定，使得利用轉基因技術提高一些主要農作物中類胡蘿卜素的含量成為可能。目前，植物類胡蘿卜素基因工程進展很大［９－１１］，轉基因“金稻”的培育就是一個突出的例子［１２］。本研究從番茄中克隆了植物類胡蘿卜素生物合成途徑中促進番茄紅素合成的八氫番茄紅素脫氫酶（ＰＤＳ）的編碼基因，并構建了該基因的超表達載體，通過農桿菌介導法獲得了轉基因番茄植株，轉基因后代株系果實中番茄紅素平均含量比對照增加了１．4倍。由此可見，超表達ＰＤＳ的編碼基因成功地達到了增加番茄果實中番茄紅素的含量和提高番茄果實營養價值的目的。

Ｆｒａｙ等［１３］的研究表明，組成型過量表達番茄ＰＳＹ的編碼基因導致轉基因番茄植株矮化。同樣，Ｂｕｓｃｈ等［１４］的研究表明，煙草ＰＳＹ的編碼基因組成型過量表達，也引起轉基因煙草植株矮化、葉片形態變化等不良反應。本研究中超表達載體采用的是ＣａＭＶ ３５Ｓ啟動子，獲得的１0株轉基因番茄植株是組成型超表達ＰＤＳ的編碼基因的，這些轉基因植株與野生型相比沒有明顯的形態學差異，這與張建成等［１５］的研究結果一致。在轉基因研究中，人們通常選擇組織或器官特異性啟動子，以減少對非靶器官或組織生長的影響。Ａｌｕｒｕ等［１６］利用特異性啟動子，將類胡蘿卜素合成途徑中的３個基因ＰＳＹ、ＰＤＳ、ＺＤＳ同時過量表達，發現轉基因玉米胚乳中積累的總的類胡蘿卜素含量是對照的３４倍。因此，在應用基因工程技術調控類胡蘿卜素生物合成途徑時，應盡量選用組織或器官特異性啟動子。

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