重組日本乙型腦炎病毒ＮS1的可溶性表達及抗原性分析

摘要：根據日本乙型腦炎病毒（ＪＥＶ）Ｗｈｅ株非結構蛋白質１（ＮＳ１）的基因序列，設計引物，利用反轉錄ＰＣＲ從實驗室保藏ＪＥＶ Ｗｈｅ株中克隆ＮＳ１全長序列，并將其插入ｐＥＴ２８ａ表達載體，構建重組表達質粒ＮＳ１－ｐＥＴ２８ａ，轉化大腸桿菌ＢＬ２１（ＥＤ３），經ＩＰＴＧ誘導，得到可溶性表達的融合蛋白質Ｈｉｓ－ＮＳ１。結果表明，該融合蛋白質分子量為４６ｋu，大量表達于上清中。鎳離子親和層析柱進行純化得到Ｈｉｓ－ＮＳ１蛋白質，經Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ檢測，證明其具有良好的免疫學活性，這為進一步研究ＪＥＶ ＮＳ１的功能及應用奠定了基礎。

關鍵詞：日本乙型腦炎；非結構蛋白質１；可溶性表達；抗原性分析

中圖分類號：Ｓ８５２．６５ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）02－0358-03

Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｓ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ

Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ 1

ＺＨＯＵ Ｄａｎ－ｎａ１，ＬＩＡＮＧ Ｗａｎｇ－ｗａｎｇ１，ＧＵＯ Ｒｕｉ１，ＤＵＡＮ Ｚｈｅｎｇ－ｙｉｎｇ１，ＬＵＯ Ｍｉｎｇ－ｊｉｅ２，ＹＡＮＧ Ｋｅ－ｌｉ１，ＹＵＡＮ Ｆａｎｇ－ｙａｎ１，ＬＩＵ Ｚｅ－ｗｅｎ１，ＴＩＡＮ Ｙｏｎｇ－ｘｉａｎｇ１

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｘｉａｎｇｙａｎｇ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｘｉａｎｇｙａｎｇ ４４１０００，Hubei，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＮＳ１ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ ｆｕｓｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｉｓ ｂｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ＮＳ１－ｐＥＴ２８ａ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ＢＬ２１（ＥＤ３）． Ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＩＰＴＧ， ｈｉｇｈ ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｉｓ－ＮＳ１ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ． ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ４６ ｋｕ ａｎｄ ｈａｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｉｄ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆuｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＪＥＶ ＮＳ１ ｐｒｏｔｅｉｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ； ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ １； ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； antigenicity analysis

日本乙型腦炎病毒（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＪＥＶ）是一種人畜共患的蚊媒病毒，可引起感染動物的高熱、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激癥等病征，還可造成動物的繁殖障礙。

ＪＥＶ屬于披膜病毒科黃病毒屬的單股正鏈ＲＮＡ病毒，病毒基因組編碼產物通過裂解和加工形成約１０個蛋白質，包括３個結構蛋白質（Ｃ、ｐｒＭ和Ｅ）和７個非結構蛋白質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ和ＮＳ５）。ＮＳ１是ＪＥＶ的非結構蛋白質之一，是一種與膜功能相關的糖蛋白，參與早期階段的病毒復制、病毒組裝和釋放，是主要的抗原成分之一。由于ＮＳ１不組成毒粒，所以沒有中和活性和血凝抑制活性，但它具有可溶性補體結合活性，可在不出現中和抗體的情況下誘生保護力，即誘生非中和性的保護力［１］。在宿主感染早期的腦脊液中雖然很難檢測到乙型腦炎病毒，但可檢測到ＮＳ１，利用ＮＳ１單抗也已建立了乙型腦炎早期感染ＩｇＭ的ＥＬＩＳＡ檢測方法［2］。ＮＳ１除具有良好的抗原性外，近年來對ＮＳ１功能的研究發現，ＮＳ１的核糖體移碼翻譯蛋白質ＮＳ１′與乙型腦炎病毒的神經侵染毒力密切相關［3］，但ＮＳ１′形成的具體機制尚不清楚。

本研究擬利用大腸桿菌表達系統，對ＮＳ１進行可溶性表達并驗證表達產物活性，以便進一步研究乙型腦炎病毒ＮＳ１的免疫機理及毒力作用。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 質粒、菌株及細胞株 ｐＥＴ２８ａ原核表達載體，宿主菌ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３），Ｖｅｒｏ細胞株以及日本乙型腦炎病毒Ｗｈｅ株均由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所獸醫研究室保存。

１．１．２ 試劑 質粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；ＲＮＡ抽提試劑盒、反轉錄試劑盒及ＫＯＤ－ｐｌｕｓ ＤＮＡ聚合酶購自日本ＴＯＹＯＢＯ公司；限制性內切酶、Ｔ４ ＤＮＡ連接酶購自Ｆｅｒｍａｎｔａｓ公司；ＤＮＡ瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京道普生物公司；純泰Ｎｉ－ＩＤＡ親和層析介質（Ｈｉｓ鎳柱）購自上海富眾儀器有限公司；羊抗鼠ＨＲＰ－ＩｇＧＦｃ購自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司。鼠源乙型腦炎多抗陽性血清由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所研究室制備。引物設計依據ＧｅｎＢａｎｋ上公布的乙型腦炎病毒Ｗｈｅ株的基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ編號：ＥＦ１０７５２３）設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。ＮＳ１－Ｆ：５’－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＣＴＧＧＡＴＧＴＧＣＣＡＴＴＧＡＣＡ－３’（Ｂａｍ ＨⅠ）；ＮＳ１－Ｒ：

５’－ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＡＧＣＡＧＣＧＡＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＡＴＡ－３’（Ｈｉｎ ｄ Ⅲ）。

１．２ 方法

１．２．１ ＪＥＶ全病毒ｃＤＮＡ的制備 將ＪＥＶ病毒干粉用磷酸緩沖液稀釋，接種到單層Ｖｅｒｏ細胞中，３７ ℃，用５％ ＣＯ２培養。收集培養上清，用ＲＮＡ抽提試劑盒提取乙型腦炎病毒ＲＮＡ，用反轉錄試劑盒制備病毒ｃＤＮＡ模板，備用。

１．２．２ ＮＳ１的擴增 利用生物學軟件Ｐｒｉｍｅｒ ５．０對ＮＳ１全基因（ＧｅｎＢａｎｋ編號：ＥＦ１０７５２３）進行序列和酶切位點分析。根據分析結果，以制備的乙型腦炎病毒Ｗｈｅ株的ｃＤＮＡ為模板，利用ＫＯＤ－ｐｌｕｓ ＤＮＡ聚合酶和引物ＮＳ１－Ｆ／ＮＳ１－Ｒ擴增ＮＳ１基因全長序列，反應條件為９４ ℃，３ ｍｉｎ；９４ ℃、２０ ｓ，６０℃、４０ｓ，６８ ℃、２ ｍｉｎ，３４個循環；６８ ℃，１０ ｍｉｎ。

１．２．３ 重組表達質粒ＮＳ１－ｐＥＴ２８ａ的構建 將ＰＣＲ產物用ＤＮＡ瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，用Ｂａｍ ＨⅠ和Ｈｉｎ ｄ Ⅲ分別對ＮＳ１擴增片段和ｐＥＴ２８ａ載體進行雙酶切、回收、連接構建重組質粒，命名為ＮＳ１－ｐＥＴ２８ａ。將連接產物轉化ＤＨ５α，篩選陽性克隆，提取質粒，進行酶切鑒定和序列測定（由上海生工生物工程技術服務有限公司完成）。

１．２．４ 重組質粒ＮＳ１－ｐＥＴ２８ａ的可溶性表達與檢測 將重組質粒ＮＳ１－ｐＥＴ２８ａ和表達載體ｐＥＴ２８ａ分別轉化大腸桿菌ＢＬ２１（ＤＥ３），挑取單菌落于含有卡那霉素（終濃度為１００ μｇ／ｍＬ）的ＬＢ培養基中，３７ ℃、２２０ ｒ／ｍｉｎ搖床培養至對數生長期（ＯＤ６００ ｎｍ＝０．６～１．０）時，加入ＩＰＴＧ（終濃度為１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ），２８ ℃分別誘導表達４、８、１２ ｈ后，收集菌體按文獻［4］所述的方法進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測。用鎳離子親和層析柱（鎳柱）純化上清中的His-ＮＳ１蛋白質進行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ所用的一抗為自制鼠源乙型腦炎多抗陽性血清，二抗為羊抗鼠ＨＲＰ－ＩｇＧＦｃ。

２ 結果

２．１ ＮＳ１的擴增結果

利用所設計引物從乙型腦炎病毒ｃＤＮＡ模板中擴增得到１ ２００ ｂｐ左右的特異性目的片段（圖１Ａ），回收目的片段，連接ｐＭＤ１８－Ｔ載體，送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。測序結果表明，該目的片段大小為１ ２４５ ｂｐ，ＢＬＡＳＴ結果表明其與Ｗｈｅ株ＮＳ１序列同源性為１００％。

２．２ 重組質粒ＮＳ１－ｐＥＴ２８ａ的酶切、測序鑒定結果

將構建的重組質粒ＮＳ１－ｐＥＴ２８ａ用Ｂａｍ ＨⅠ／Ｈｉｎ ｄ Ⅲ進行雙酶切鑒定，結果見圖１Ｂ。用Ｂａｍ ＨⅠ／Ｈｉｎ ｄ Ⅲ雙酶切則出現約５．０ ｋｂ的載體片段和約１．２ ｋｂ的外源片段（ＮＳ１）兩條帶。將重組質粒ＮＳ１－ｐＥＴ２８ａ送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，測序結果進一步證明重組表達質粒ＮＳ１－ｐＥＴ２８ａ構建正確，未出現讀碼框移碼現象。

２．３ 重組質粒ＮＳ１－ｐＥＴ２８ａ的表達與檢測結果

ＮＳ１－Ｈｉｓ蛋白質預測大小為４６ｋu，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果表明（圖２），含ＮＳ１－ｐＥＴ２８ａ重組質粒的Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１誘導后在約４６ｋu處具有明顯的表達帶，是ＮＳ１與Ｈｉｓ融合表達的蛋白質，而ＩＰＴＧ誘導前在此處未見明顯條帶。空載體對照在誘導前后未見有差異條帶表達。收集誘導菌體并破碎、離心后，上清與包涵體分別制樣，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ顯示，His-ＮＳ１蛋白質大量表達在上清中，為可溶性表達，鎳柱純化His-ＮＳ１后，蛋白液中的雜蛋白基本被除去（圖２）。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析表明His-ＮＳ１能夠與鼠源乙型腦炎多抗陽性血清發生特異性的免疫反應，說明所克隆的ＮＳ１成功獲得了可溶性表達，表達產物具有良好的免疫反應活性（圖３A和圖3B）。

３ 討論

日本乙型腦炎病毒ＮＳ１是分泌型的糖蛋白，抗還原反應，抗ＳＤＳ，但不耐熱，常以二聚體（Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）的形式存在于培養液或者血清中，有人證實ＮＳ１以二聚體這種高分子形式出現是黃病毒感染的一個特征［5］。ＮＳ１作為研究亞單位疫苗候補抗原的最大特點是不產生抗體依賴性，因此引起了研究者的極大關注。此外，黃病毒科所有病毒的ＮＳ１具有高度同源性，對乙型腦炎病毒ＮＳ１的功能的研究可為黃病毒科其他病毒相關蛋白的研究提供依據。

蛋白質的大量重組表達以及純化，一直是研究蛋白質理化性質與功能的基礎。大腸桿菌表達系統因其宿主菌遺傳背景清楚、表達高效且經濟方便等優勢，是迄今為止最常見、應用最廣泛的原核表達系統。但該表達系統也有局限性，當所表達的外源蛋白質是復雜的真核來源蛋白質時，因不能正確翻譯出多肽鏈的正確折疊修飾，使得表達的蛋白質失去天然構象，形成不溶性的無功能包涵體。因此，提高重組蛋白質的可溶性表達是研究蛋白質功能活性的關鍵。宿主表達菌及載體的選擇、培養條件誘導方法的選擇均可對外源蛋白質可溶性表達產生影響。Ｉｇｎａｔｏｖａ等［6］采用不同的大腸桿菌宿主菌表達青霉素酰化酶，優化培養基后，發現蛋白酶缺失的宿主菌ＢＬ２１（ＥＤ３）表達該活性可溶性蛋白質優勢明顯。低溫培養能提高外源蛋白質的可溶性表達，雖然目前尚沒有滿意的原因解釋，但不少研究人員認為，低溫能降低蛋白質的合成速率，改變多肽折疊的動力學，從而導致正確折疊的蛋白質增加［7］。為了得到ＮＳ１的可溶性表達，該研究使用ＢＬ２１（ＥＤ３）作為表達宿主菌，調整培養溫度為２８ ℃。經檢測，獲得了ＮＳ１的可溶性表達蛋白質，并用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ證實了該可溶性蛋白質的活性。低溫誘導表達時進行了3個誘導時間平行試驗，通過ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢驗發現，誘導８ ｈ時的蛋白質表達量最大，優于４ ｈ和１２ ｈ。分析其原因可能是因為重組蛋白質為可溶性表達，１２ ｈ的培養時間過長，宿主菌內的蛋白酶對其進行了水解，造成重組蛋白質產量低于８ ｈ。

綜上所述，本研究以原核表達方式，通過宿主菌的選擇和培養溫度的選擇，獲得了乙型腦炎病毒ＮＳ１的可溶性表達，過柱純化獲得了該重組蛋白質。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ證實了該重組蛋白質具有良好的免疫反應活性，為進一步研究日本乙型腦炎病毒ＮＳ１的功能及應用奠定了基礎。

參考文獻：

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