不同濃度激素對(duì)蕨菜愈傷組織誘導(dǎo)與增殖的影響

摘要：以蕨菜［Ｐｔｅｒｉｄｉｕｍ ａｑｕｉｌｉｎｕｍ（Ｌ．）ｋｕｈｎ］幼嫩根狀莖為外植體，在愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基中設(shè)置不同的６－ＢＡ和ＩＢＡ濃度，研究６－ＢＡ和ＩＢＡ對(duì)蕨菜愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的影響。結(jié)果表明，１／２ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．４ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ為愈傷組織的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為８２％；１／２ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ為愈傷組織的最佳增殖培養(yǎng)基，增殖倍數(shù)為８．０７。該研究結(jié)果為６－ＢＡ和ＩＢＡ在蕨菜愈傷組織培養(yǎng)中的合理使用提供了參考。

關(guān)鍵詞：激素；蕨菜［Ｐｔｅｒｉｄｉｕｍ ａｑｕｉｌｉｎｕｍ（Ｌ．）ｋｕｈｎ］；愈傷組織；誘導(dǎo)；增殖

中圖分類號(hào)：Ｓ６４７；Ｑ９４３．１ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）02－0406-03

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｏｎ Ｃａｌｌｕｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ

Ｐｔｅｒｉｄｉｕｍ ａｑｕｉｌｉｎｕｍ（Ｌ．） kｕｈｎ

ＦＡＮＧ Ｌｉ－ｊｕａｎ，ＳＵ Ｓｈｉ－ｌｉｎ，ＰＵ Ｓｈｉ－ｍｉｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂａｉｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂａｉｓｅ ５３３０００， Ｇｕａｎｇｘｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｔｅｎｄｅｒ ｒｈｉｚｏｍｅｓ ｏｆ ｆｅｒｎ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ， ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ６－ＢＡ ａｎｄ ＩＢＡ ｗｅｒｅ ａｄｄｅｄ ｉｎ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍｓ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ １／２ ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．４ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ８２％； １／２ ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃａｌｌｕｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｓ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ ｂｙ ８．０７ ｔｉｍｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ ｕｓｅ ｏｆ ６－ＢＡ ａｎｄ ＩＢＡ ｉｎ ｃａｌｌｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｔｅｒｉｄｉｕｍ ａｑｕｉｌｉｎｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈｏｒｍｏｎｅｓ； Ｐｔｅｒｉｄｉｕｍ ａｑｕｉｌｉｎｕｍ（Ｌ．） kｕｈｎ； callus； ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ； ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ

蕨菜［Ｐｔｅｒｉｄｉｕｍ ａｑｕｉｌｉｎｕｍ（Ｌ．）ｋｕｈｎ］又名如意菜、龍頭菜等，為風(fēng)尾蕨科蕨屬多年生草本植物的嫩苗［１］。其分布很廣，除沙漠外，從高山至海關(guān)、從寒帶到熱帶都有生長(zhǎng)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蕨菜植物的應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓寬，其應(yīng)用價(jià)值也不斷提高，據(jù)資料顯示，蕨菜營(yíng)養(yǎng)豐富、質(zhì)脆、味鮮，尤其是蕨菜內(nèi)含有１７種氨基酸，人體所需的８種必需氨基酸（色氨酸未檢出）占其氨基酸總含量的３９．４％［２－５］。另外，從中醫(yī)藥角度來看，蕨菜味甘性寒，全株可入藥，具有利尿解熱、化痰、活血、化淤、防癌、減肥等功效。因此，近幾年受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)，人工大面積采挖使野生蕨菜資源受到極大破壞，為達(dá)到持續(xù)利用的目的，保存和恢復(fù)蕨菜資源，對(duì)蕨菜進(jìn)行人工繁殖勢(shì)在必行。

本研究利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，研究不同濃度的激素對(duì)蕨菜愈傷組織誘導(dǎo)與增殖的影響，以建立蕨菜根狀莖高效誘導(dǎo)愈傷組織體系，對(duì)該植物的開發(fā)及研究具有重要意義。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 外植體 蕨菜幼嫩根狀莖莖段采摘于廣西壯族自治區(qū)百色市郊外的麒麟山山麓及凌云、樂業(yè)縣多個(gè)向陽、背陽山坡。

１．１．２ 培養(yǎng)條件 愈傷組織誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基均以１／２ＭＳ為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的激素，其中蔗糖為３０ ｇ／Ｌ，瓊脂為８ ｇ／Ｌ。培養(yǎng)溫度為２５ ℃，光照度為２ ０００ ｌｘ，光照時(shí)間為１３ ｈ／ｄ。

１．２ 方法

１．２．１ 外植體取材與消毒 取蕨菜根狀嫩莖，去掉較老莖段和葉片，放于燒杯中，先用自來水流水沖洗１０ ｍｉｎ，再用洗衣粉水浸泡５ ｍｉｎ，后用流水沖洗至無泡沫時(shí)放置于超凈工作臺(tái)上。先用體積分?jǐn)?shù)為７５％的乙醇溶液浸潤(rùn)１５ ｓ后，迅速用無菌水沖洗１次，再用ＨｇＣｌ２溶液振蕩滅菌，最后用無菌水沖洗４～５次，即獲得無菌材料。

１．２．２ 愈傷組織的誘導(dǎo) 將經(jīng)過表面消毒的無菌蕨菜根狀莖段切割為１．０ ｃｍ左右的小段，按形態(tài)學(xué)上部向上的原則，將所切取的外植體，直插于附加了不同濃度激素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，插入深度約為外植體長(zhǎng)度的１／３，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。

１．２．３ 愈傷組織的增殖 選擇誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)良好的蕨菜愈傷組織，在無菌條件下分散成大小約為０．５ ｃｍ３的愈傷組織小塊，接種至附加了不同濃度激素的愈傷組織增殖培養(yǎng)基中，進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)。３０ ｄ后稱量統(tǒng)計(jì)。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 蕨菜莖段的消毒結(jié)果

采用體積分?jǐn)?shù)為７５％的乙醇溶液和不同濃度的ＨｇＣｌ２消毒液，在不同的時(shí)間內(nèi)對(duì)蕨菜莖段進(jìn)行消毒，然后在基本培養(yǎng)基１／２ＭＳ上培養(yǎng)一個(gè)月后，觀察結(jié)果見表１。由表１可知，蕨菜莖段在用７５％乙醇溶液處理１５ ｓ的情況下，在ＨｇＣｌ２濃度由０．５ mg/L遞增至２.０ mg/L的過程中，污染瓶數(shù)、污染率、成活瓶數(shù)、成活率均呈降低趨勢(shì)（取ＨｇＣｌ２各濃度水平的平均值）；同一ＨｇＣｌ２濃度下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，污染瓶數(shù)、污染率、成活瓶數(shù)、成活率也呈降低趨勢(shì)。此結(jié)果表明，高濃度ＨｇＣｌ２長(zhǎng)時(shí)間的處理能夠有效降低蕨菜莖段組培過程中的污染情況，但同時(shí)也降低了莖段的成活率，綜合考慮污染率和成活率，表１中方案３的消毒結(jié)果最佳，即用７５％乙醇溶液消毒１５ ｓ，然后用1.0 mg/L ＨｇＣｌ２消毒５ ｍｉｎ，此時(shí)蕨菜莖段的污染率為２０．０％，成活率為６３．３％。

２．２ 不同濃度激素對(duì)蕨菜莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將無菌材料接種到不同濃度激素的１／２ＭＳ培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，接種２０ ｄ左右，部分培養(yǎng)基上的外植體開始形成愈傷組織，初始時(shí)直徑約１ ｍｍ、黃綠色顆粒狀，隨后逐漸長(zhǎng)成鮮綠色較大顆粒狀。由于培養(yǎng)基激素組合與濃度配比不同，對(duì)莖段愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果差異較大。具體結(jié)果見表２及圖１。

由表２可見，１／２ＭＳ培養(yǎng)基中不添加任何激素就能夠誘導(dǎo)愈傷組織，但此時(shí)誘導(dǎo)率低，僅為１８％，當(dāng)培養(yǎng)基中添加ＩＢＡ、６－ＢＡ后，愈傷組織的誘導(dǎo)率均有所提高；當(dāng)６－ＢＡ濃度恒定不變時(shí)，ＩＢＡ濃度為０．１～０．４ ｍｇ／Ｌ時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨ＩＢＡ濃度增加而增加，當(dāng)ＩＢＡ濃度為０．４～０．６ ｍｇ／Ｌ時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨ＩＢＡ濃度增加而降低，ＩＢＡ濃度為０．４ ｍｇ／Ｌ時(shí)，各６－ＢＡ濃度水平下的愈傷組織誘導(dǎo)率均達(dá)到最大值，ＩＢＡ濃度為０．６ ｍｇ／Ｌ時(shí)，愈傷組織后期的分化比較困難，且在愈傷組織中心出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象（圖１Ａ）；當(dāng)ＩＢＡ濃度不變時(shí)，６－ＢＡ濃度為０．１～０．２ ｍｇ／Ｌ時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨６－ＢＡ濃度的增加而增加，當(dāng)６－ＢＡ濃度為０．２～０．３ ｍｇ／Ｌ時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨６－ＢＡ濃度增加而降低，６－ＢＡ濃度為０．２ ｍｇ／Ｌ時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到最大值，即１／２ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．４ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ培養(yǎng)基是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基，此時(shí)誘導(dǎo)率為８２%，愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)良好，結(jié)構(gòu)疏松易分離（圖１Ｂ），光學(xué)顯微鏡下觀察其細(xì)胞形狀多為圓形和橢圓形，細(xì)胞排列無規(guī)則（圖１Ｃ），且此時(shí)愈傷組織的分化比較容易（圖１Ｄ），顯微鏡下能夠看到明顯加厚的細(xì)胞壁及豐富的葉綠體（圖１Ｅ）。

２．３ 不同濃度激素對(duì)蕨菜愈傷組織增殖的影響

由表３的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，培養(yǎng)３０ ｄ后，不同濃度激素的培養(yǎng)基中均能形成仍具有分化能力的綠色顆粒狀愈傷組織。其中增殖倍數(shù)最大的方案為附加０．２ ｍｇ／Ｌ的ＩＢＡ和０．４ ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ，此時(shí)增殖倍數(shù)為８．４８，但此時(shí)愈傷組織出現(xiàn)了不同程度的壞死，壞死部分開始于與培養(yǎng)基接觸處，再逐漸擴(kuò)展到整個(gè)愈傷組織，如同誘導(dǎo)階段的壞死現(xiàn)象。在６－ＢＡ濃度恒定的水平下，增殖倍數(shù)在ＩＢＡ濃度為０．２ ｍｇ／Ｌ時(shí)達(dá)到最大值；在ＩＢＡ濃度恒定的水平下，增殖倍數(shù)隨6-BA濃度變化復(fù)雜，即當(dāng)ＩＢＡ濃度為0.1~0.2 ｍｇ／Ｌ時(shí)，增殖倍數(shù)隨６－ＢＡ濃度的增加而增加，當(dāng)ＩＢＡ濃度為0.2~0.4 ｍｇ／Ｌ時(shí)，增殖倍數(shù)隨６－ＢＡ濃度的增加而降低。綜合考慮愈傷組織增殖倍數(shù)及生長(zhǎng)情況，１／２ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ培養(yǎng)基是愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基，此時(shí)增殖倍數(shù)為８．０７，且愈傷組織質(zhì)地較為疏松，易分離、易分化（見圖１Ｆ），在誘導(dǎo)及增殖階段都發(fā)現(xiàn)組培物表面長(zhǎng)有白色的腺毛（圖１Ｇ），顯微鏡下觀察到腺毛中有豐富的質(zhì)體（圖１Ｈ）。

３ 結(jié)論與討論

１）試驗(yàn)證明，在不添加任何激素的情況下，蕨菜的幼嫩根狀莖段就可以在１／２ＭＳ培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)形成愈傷組織，這主要是由于１／２ＭＳ的營(yíng)養(yǎng)成分比較適合蕨菜的生長(zhǎng)［６］，同時(shí)試驗(yàn)取材正好是春季，蕨菜幼嫩根狀莖段中必然含有一定量的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，所以細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂能力都比較強(qiáng)，故而較易形成愈傷組織。試驗(yàn)中，１／２ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．４ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ培養(yǎng)基是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基，這與姜長(zhǎng)陽等［７］和周曉麗等［８］的研究結(jié)果是相同的，但試驗(yàn)中誘導(dǎo)率為８２%，高于其他相關(guān)文獻(xiàn)中的數(shù)值［９－１１］。

２）由試驗(yàn)得知，增殖倍數(shù)最大的方案為１／２ ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ＋０．４ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ，增殖倍數(shù)為８．４８，但此時(shí)愈傷組織出現(xiàn)了不同程度的壞死，這主要是６－ＢＡ濃度過高對(duì)愈傷組織的抑制造成的。而在１／２ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ的培養(yǎng)條件下，增殖倍數(shù)為８．０７，且愈傷組織質(zhì)地較為疏松，易分離、易分化，故１／２ＭＳ＋０．２ｍ ｇ／Ｌ ＩＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ為蕨菜根狀莖愈傷組織的最佳增殖培養(yǎng)基。

３）腺毛在蕨菜的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)的研究中時(shí)有報(bào)道［１２］，本研究在誘導(dǎo)及增殖階段皆發(fā)現(xiàn)了蕨菜組培物表面有白色腺毛，這在蕨菜的組織培養(yǎng)過程中是首次發(fā)現(xiàn)，其在組織培養(yǎng)中的具體作用還有待于進(jìn)一步研究。

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