茶尺蠖核型多角體病毒多克隆抗體的制備及檢測應用

摘要：以純化的茶尺蠖核型多角體病毒（Ｅｃｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ，ＥｃｏｂＮＰＶ）作為抗原免疫大耳白兔，獲得多克隆抗體，Ｉｎｄｉｒｅｃｔ－ＥＬＩＳＡ效價為１∶５１ ２００；工作濃度分別為ＥｃｏｂＮＰＶ １∶１ ６００、兔抗血清１∶３ ２００。用所制備的多克隆抗體對提純的多角體進行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析表明制得的抗體對茶尺蠖核型多角體病毒有良好的特異性。應用于不同來源茶園昆蟲多角體病毒分離株的檢測，取得了理想的檢測效果。

關鍵詞：茶尺蠖核型多角體病毒；純化；抗體制備；檢測

中圖分類號：Ｑ９３－３３１；Ｓ４７６＋．１１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）02－0298-04

Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ aｇａｉｎｓｔ Ｅｃｔｒｏｐｉｓ Oｂｌｉｑｕａ Nｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ

ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ＴＡＮ Ｒｏｎｇ－ｒｏｎｇ１，２，ＬＩＵ Ｍｉｎｇ－ｙａｎ１，２，ＧＯＮＧ Ｚｉ－ｍｉｎｇ１，２，ＨONG Ｎｉ３，ＭＡＯ Ｙｉｎｇ－ｘｉｎ１，２

（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｒｕｉｔ ａｎｄ Ｔｅａ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３０２０９，Ｃｈｉｎａ；；

２． Ｈｕｂｅｉ Ｔｅａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｗｕｈａｎ ４３０２０９，Ｃｈｉｎａ；

３． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｄｏｏｒ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｖｉｒｕｓ－ｆｒｅｅ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｏｆ Ｆｒｕｉｔ Ｃｒｏｐｓ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ，４３００７０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ aｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇ ｒａｂｂｉｔｓ ｗｉｔｈ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＥｃｏｂＮＰＶ； Aｎｄ ｉｔｓ ｔｉｔｅｒ ａｎｄ ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗas １∶５１ ２００， １∶１ ６００ ｉｎ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｗａｓ １∶３ ２００． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｉｎ Ｅｃｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕａ Ｐｒｏｕｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅｓ． Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ rｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ was ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＥｃｏｂＮＰＶ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅａ ｇａｒｄｅｎｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＥｃｏｂＮＰＶ ｑｕｉｃｋｌｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅｃｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ； ｐｕｒｉｆｉｅｄ； ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ； ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

有關利用酶聯免疫技術檢測昆蟲病毒的方法，國內外已有相關文獻報道。如Ｃｒｏｏｋ等［1］利用3種不同類型的ＥＬＩＳＡ法檢測桿狀病毒；張光裕等［2］等用單克隆抗體結合酶聯免疫吸附試驗檢測云杉卷葉蛾幼蟲體內的核型多角體病毒；陳建國等［3］應用菜粉蝶顆粒體病毒單克隆抗體對不同株系病毒進行抗原分析；石正麗等［4］測定了茶毛蟲核型多角體病毒的血清學特性；黃亞欣等［5］利用ＥＬＩＳＡ對斜紋夜蛾核型多角體病毒進行了定量檢測分析。茶尺蠖核型多角體病毒（Ｅｃｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ，ＥｃｏｂＮＰＶ）是一種環狀閉合雙鏈ＤＮＡ病毒，該病毒屬于桿狀病毒科核型多角體病毒屬，大量研究表明該病毒對宿主昆蟲有較高的致病性，對人、畜安全，亦不污染自然環境［6］。該病毒１９８７年在湖北省農業科學院果樹茶葉研究所茶園分離得到，是防治茶園茶尺蠖的有效生物因子［7］。研究該病毒的感染和復制機制及在自然界的流行規律，建立快速、穩定、靈敏度高、特異性強而又安全的檢測方法至關重要。本研究利用提純的茶尺蠖核型多角體病毒蛋白，制備其特異性多克隆抗體，建立Ｉｎｄｉｒｅｃｔ－ＥＬＩＳＡ檢測方法，為進一步研究該病毒的血清學特性及建立高通量、快速的病毒檢測技術奠定基礎。

１ 材料與方法

１．１ 材料

用于病毒提純和檢測的樣品均來源于感染ＥｃｏｂＮＰＶ死亡的茶尺蠖蟲體，由湖北省農業科學院果樹茶葉研究所茶植保課題組提供。

１．２ 病毒提純

采用常規病毒提純方法。收集感染ＥｃｏｂＮＰＶ致死的蟲尸，加入ＰＢＳ緩沖液充分研磨后，再經過４層紗布過濾，濾液４ ℃條件下５００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ棄沉淀，上清液３ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心３０ ｍｉｎ。用適量緩沖液重新懸浮沉淀，３ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心３０ ｍｉｎ。差速離心反復進行多次，直至多角體懸液呈乳白色狀。加適量緩沖液重新懸浮沉淀，懸浮液用４０％～６０％蔗糖密度梯度離心（４ ０００ ｒ／ｍｉｎ）２ ｈ，分層取樣。ＥＬＩＳＡ法確定病毒所在的位置，再將含病毒的樣品混合，加無菌水離心清洗３次，少量無菌水懸浮沉淀。最后將純化的多角體進行超速離心（Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８轉頭，２２ ０００ ｒ／ｍｉｎ，９０ ｍｉｎ）濃縮病毒，加少量的硼酸緩沖液（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＢＯ４－Ｈ３ＢＯ３）懸浮沉淀，４ ℃過夜。

１．３ 多克隆抗體的制備

１．３．１ 免疫方案 以純化的多角體蛋白作為抗原免疫雄性大耳白兔。免疫之前，從兔耳靜脈采血，分離血清，－２０ ℃保存作為陰性對照血清［8］。

首次免疫時抗原與等量的完全福式佐劑乳化，肌肉多點注射（１ ｍL／只），以后仍為肌肉多點注射，每隔７ ｄ注射１次，共免疫４次。末次注射１４ ｄ后心臟采血測定血清效價。

１．３．２ 抗血清的收集和保存 免疫后的雄性大耳白兔在采血前數小時禁食，采集血樣即置于３７ ℃烘箱２ ｈ使之凝固后在４ ℃冰箱過夜，收集淡黃色血清轉移至離心管中，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ。收集上清液分裝于１．５ ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中， －２０ ℃冰箱保存［9］。

１．４ 提純病毒的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析

以健康蟲體提取液作陰性對照進行提純病毒的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析［10］。先進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測，電泳后將各孔道電泳膠切割，一部分用于考馬斯亮藍染色，一部分進行電轉移。用于電轉移的電泳膠先轉移至平衡好的ＰＶＤＦ膜，電轉移２ ｈ后將ＰＶＤＦ膜用５％脫脂奶進行封閉，轉入多克隆抗體稀釋液中，３７ ℃孵育２ ｈ，ＰＢＳＴ洗滌３次，再將膜轉入稀釋的堿性磷酸酯酶（ＡＰ）標記的羊抗兔ＩｇＧ中，３７ ℃孵育２ ｈ，經洗滌后用底物氮藍四唑（ＮＢＴ）和５－溴－４－氯－３－吲哚磷酸二鈉鹽（ＢＣＩＰ）顯色，觀察結果。

１．５ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ－ＥＬＩＳＡ測定

以差速離心得到的多角體粗提液作為抗原，健康蟲體的體液作陰性對照。采用Ｉｎｄｉｒｅｃｔ－ＥＬＩＳＡ測定所制備多克隆抗體的效價和最適工作濃度。抗原用碳酸包被緩沖液按１∶１ ０００倍稀釋后包被聚苯乙烯微量反應板，每孔１００ μＬ，４ ℃孵育過夜，ＰＢＳＴ洗滌３次，每次５ ｍｉｎ。加入封閉緩沖液３７ ℃孵育１ ｈ后，抗體與ＰＢＳＴ按１∶１００ ～１∶５１ ２００稀釋加入ＥＬＩＳＡ板，孵育２～４ ｈ，最后加入辣根過氧化物酶（ＨＲＰ）標記的羊抗兔抗體（１∶５ ０００稀釋），經ＨＲＰ催化底物四甲基聯苯胺（ＴＭＢ）反應，２ ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４終止反應后用５５０型酶標儀（ＢＩＯ－ＲＡＤ）測ＯＤ４５０nm值，根據陽性樣品與陰性對照吸光值之比（Ｐ／Ｎ）確定抗體的效價及最適工作濃度［11］。

２ 結果與分析

２．１ 病毒提純

差速離心后的病毒初提液經蔗糖密度梯度離心后，未見明顯的病毒分布帶，采取分層取樣的方法，從上至下共取１１層，從下向上編號，每層約１ ｃｍ，用所制的多克隆抗體測定各層中病毒相對含量（圖１），結果可見，Ｉｎｄｉｒｅｃｔ－ＥＬＩＳＡ檢測時，病毒吸光值以底部樣品（樣品１－３）較高，向離心管頂部明顯降低，在離管底約２ ｃｍ處（樣品２）形成一峰值，即病毒主要集中在樣品２中，樣品１和３也含有一定量的病毒。因此，取離管底１ ｃｍ、２ ｃｍ、３ ｃｍ處懸液離心洗去蔗糖，得到純凈的多角體。４ ℃保存。

２．２ 病毒提純效果分析

利用多克隆抗體對提純的病毒進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析，以未感染病毒的健康茶尺蠖的提取物為陰性對照。結果表明蔗糖密度梯度離心后得到的病毒粗提液和差速離心得到的多角體粗制品在ＳＤＳ-ＰＡＧＥ上均可見較清晰的蛋白條帶，ＰＶＤＦ膜上能產生較強的特異免疫反應條帶（圖2）。

２．３ 多克隆抗體的效價

采用Ｉｎｄｉｒｅｃｔ－ＥＬＩＳＡ法，以純化的ＥｃｏｂＮＰＶ作為抗原，以健康茶尺蠖體液作為陰性對照，多克隆抗體從１∶１００開始倍量稀釋，測得所制備ＥｃｏｂＮＰＶ多克隆抗體的間接ＥＬＩＳＡ效價為１∶５１ ２００，當抗體稀釋到１∶３ ２００時，Ｐ／Ｎ值最高（表1），即為Ｉｎｄｒｅｃｔ－ＥＬＩＳＡ的最適工作濃度。

２．４ 多克隆抗體Ｉｎｄｉｒｅｃｔ－ＥＬＩＳＡ法檢測ＥｃｏｂＮＰＶ的適宜的工作濃度

方陣滴定法測定Ｉｎｄｉｒｅｃｔ－ＥＬＩＳＡ抗原、抗體的最佳工作濃度。在抗原稀釋倍數一定時，陰性樣品和陽性樣品的吸光值均隨抗體稀釋倍數的增加而降低，但在不同的組合中Ｐ／Ｎ值有一定的差異（表２），當茶尺蠖核型多角體病毒ＥｃｏｂＮＰＶ工作濃度為１∶１ ６００、兔抗茶尺蠖核型多角體病毒抗血清工作濃度為１∶３ ２００時，Ｐ／Ｎ值（２６．8）最大，因此選擇該濃度組合作為Ｉｎｄｉｒｅｃｔ－ＥＬＩＳＡ檢測時多克隆抗體的適宜工作濃度。

２．５ 多克隆抗體對不同來源茶園昆蟲多角體病毒分離株的檢測應用

采用所制備的多克隆抗體，對從茶園分離的不同昆蟲核型多角體病毒分別進行Ｉｎｄｉｒｅｃｔ－ＥＬＩＳＡ 法檢測，以健康茶尺蠖體液為陰性對照。結果（表３）可以看出，檢測其他害蟲的核型多角體病毒的吸光值差異較大，且Ｐ／Ｎ均小于２，呈陰性反應。而對于來源相同的茶尺蠖核型多角體病毒，其吸光值隨著幼蟲的成長而呈現遞增趨勢，當蟲齡增至三齡后，Ｐ／Ｎ大于２，呈陽性反應（二齡幼蟲體內病毒剛攝入，還未開始大量復制，故呈陰性反應），由此可見所制備的多克隆抗體特異性較強，應用Ｉｎｄｉｒｅｃｔ－ＥＬＩＳＡ法可以快速有效地應用于茶尺蠖核型多角體病毒的檢測。

３ 討論

隨著現代生物技術的發展，新的病毒檢測技術不斷出現，如核酸雜交、ＰＣＲ技術、構建表達綠色熒光蛋白（ＧＦＰ）等。但是基于多克隆抗體的免疫學檢測技術，由于具有靈敏、特異、實用、安全等特點，仍有不可替代的作用［12］。

免疫血清的制備是一項常用的免疫學實驗技術，高效價、高特異性的免疫血清可作為免疫學診斷的試劑，也可供特異性免疫治療用。制備過程中主要有抗原純化、免疫方案和免疫動物的選擇以及免疫血清的采集、效價的測定等主要環節。其中免疫方案（包括抗原的劑量、免疫途徑、免疫次數和免疫注射間隔時間等）對抗體效價影響尤為明顯。本研究用純化的茶尺蠖核型多角體病毒為抗原，成功制備了針對該病毒的多克隆抗體，并利用制備的多克隆抗體進行Ｉｎｄｉｒｅｃｔ－ＥＬＩＳＡ法檢測和檢測效果的評價，這在國內尚屬首次報道。試驗獲得了理想的檢測效果，這說明所制備抗體和所建立檢測方法的可靠性強。多克隆抗體用于Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析時，需對抗體進行吸附，在吸附不完全時易出現非特異性反應。

各主要茶區利用病毒防治茶尺蠖已成為目前茶園生物防治的一個亮點。病毒的檢測是茶園生物防治和有機茶生產過程中的一個重要環節。因此，ＥｃｏｂＮＰＶ多克隆抗體的獲得及檢測系統的建立有利于了解茶園中病毒的發生分布，也為有機茶園的推廣提供了技術手段。

參考文獻：

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［3］ 陳建國，胡 萃，馬 可，應用菜粉蝶顆粒體病毒單克隆抗體對不同株病毒進行抗原分析［Ｊ］．病毒學報，１９８８，４（２）：１３７－１４０．

［4］ 石正麗，張立人，陳棣華． 茶毛蟲核型多角體病毒的血清學特性［Ｊ］．中國病毒學，１９９２，７（３）：２７６－２８２．

［5］ 黃亞欣．斜紋夜蛾核型多角體病毒的定量檢測分析［Ｊ］．昆蟲天敵，１９９５，１７（３）：９９～１０５．

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