杜仲組織培養的研究

摘要：為了篩選出杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）組織培養的最優培養條件，主要從外植體的選擇、基本培養基、植物激素、光照條件、其他理化條件等方面對杜仲愈傷組織的誘導、增殖及分化培養的影響進行了綜述，分析了杜仲組織培養過程中常見的問題并提出了解決方案，以期為杜仲快繁體系的建立提供理論依據。

關鍵詞：杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）；組織培養；誘導；增殖；再分化

中圖分類號：Ｓ５６７．１＋９ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）02－0228-04

Ｒｅｓｅａｒｃｈ oｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｅｕｃｏｍｍｉａ uｌｍｏｉｄｅｓ

ＹＵＡＮ Ｙｕｎ－xｉａｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｗｅｉｎａｎ Ｔｅａｃｈｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｉｎａｎ ７１４０００，Ｓｈａａｎｘｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｃｏｍｍｉａ uｌｍｏｉｄｅｓ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ， ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ conditions for Ｅ. uｌｍｏｉｄｅｓ ｃａｌｌｕｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ the aspects of ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔｓ， ｂａｓｉｃ ｍｅｄｉｕｍ， ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅｓ， ｌｉｇｈｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ Ｅ. uｌｍｏｉｄｅｓ Ｏｌｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｎ Ｅ. uｌｍｏｉｄｅｓ ｒａｐｉｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ； ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ； ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ； ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）系杜仲科杜仲屬（Ｅｕｃｏｍｍｉａ）植物，為我國特有的經濟樹種，是一種名貴的藥用植物，特別是對血壓有雙向調節作用，被認為是世界上高效天然降壓藥物［１］。杜仲還是一種膠源植物，杜仲膠具有良好的絕緣性、抗酸堿性、熱塑性和形狀記憶等特點，受到世人的普遍重視［２］。因此，杜仲作為用材、水土保持、綠化的經濟樹種，集“一林、一膠、兩材、三效益”于一體，應用前景廣闊［３］。由于杜仲是雌雄異株植物，授粉較為困難，種子產量有限，加之自然環境的破壞和長期無計劃的采挖，以及扦插繁殖的技術問題還未得到完全解決，使得杜仲的供應十分困難，生產中種苗的數量缺口很大。組織培養是解決種苗快繁的有效方法之一［４］。

杜仲是組織培養較為困難的一種木本植物。目前對杜仲愈傷組織的誘導、增殖方面的研究已有一些報道［５］。本研究在前人工作的基礎上，綜述了在不同時間采集，以杜仲幼葉、嫩莖及種子無菌苗的下胚軸、子葉、真葉、根為外植體愈傷組織的誘導、增殖、分化及生根的培養基、激素、光照等理化條件，目的在于找出杜仲的愈傷組織誘導、增殖繼代、分化及生根的最優培養條件［６］，以期為大規模培養生產杜仲及次生代謝產物奠定基礎。

１ 外植體的選擇

高等植物幾乎所有的器官和組織都可以作為外植體，在合適的時間，選擇適宜的苗齡、合適部位的外植體是有效誘導愈傷組織的關鍵［６］。同類型的外植體對于誘導產生愈傷組織的難易程度不同，主要是不同的外植體其內源激素是有差別的［７］。杜仲組織培養多采用植株的幼葉、嫩莖及種子無菌苗的下胚軸、子葉、真葉、根為外植體。其中，使用頻率最高的為莖尖［８］。

１．１ 外植體的種類

據羅麗等［７］的報道，杜仲各種外植體的誘導出愈能力比為下胚軸＞子葉＞幼葉，只要培養基中激素配比適宜，杜仲各類外植體均能誘導產生愈傷組織。另據李琰等［９］報道，以杜仲無菌苗作為外植體不僅出愈率高，愈傷組織生長旺盛，且不受季節影響，其中以下胚軸作外植體時，誘導率和生長狀況最佳；以幼葉作為外植體時，污染小，便于消毒，出愈率也高；而對于莖，雖然誘導率高，但誘導出的愈傷組織不利于繼代，且污染率高，誘導率有下降趨勢。此外，邱曉芳等［１０］用杜仲無菌苗不同組織作為外植體，得出與上胚軸相比子葉更不易產生褐化，較容易進行穩定的繼代；子葉和上胚軸均有利于誘導出疏松的愈傷組織，而上胚軸所誘導的愈傷組織質地非常疏松似乎更有利于作細胞懸浮培養。可見，以胚軸作為外植體不僅誘導率高且不易褐化，愈傷組織生長茂盛穩定，是最優選擇。

１．２ 外植體大小、接種方式及采樣時期

在杜仲組織培養過程中，不同接種方式的出愈率明顯不同。李琰等［９］的研究表明，對不同外植體：將真葉、子葉切成０．５ ｃｍ×０．５ ｃｍ方塊，下胚軸和根切成０．７ ｃｍ長的段進行接種；將幼莖切成０．７ ｃｍ長段，幼葉切成０．５ ｃｍ×０．５ ｃｍ的方塊接種方式為佳。其中以幼莖為外植體，莖段的大小和接種方式以０．７ ｃｍ長度橫放方式誘導效果最好。外植體的采用時期：田間材料幼葉取樣時間以３月中旬為好，幼莖的取材時間以４月中旬前為最佳。

２ 培養基的選擇

培養基是植物組織培養的物質基礎，也是愈傷組織能否成功的重要因素之一，愈傷組織能否形成，一方面取決于培養基材料本身的性質，另一方面也取決于培養基的種類和成分，因此要根據不同的外植體以及不同的培養目的選擇合適的培養基［６］。杜仲組織培養常用的培養基有ＭＳ、Ｂ５、ＬＳ、Ｗｈｉｔｅ、１／２ＭＳ、Ｎ６等，其中以ＭＳ使用最多，初代培養中占８３．３％，繼代培養也有６６．７％，而６６．７％的生根培養基采用的是１／２ＭＳ［８］。

２．１ 誘導培養基

研究表明，Ｂ５培養基更有利于松散愈傷組織的形成，更適合作繼代或懸浮培養；而ＭＳ培養基對子葉及上胚軸愈傷組織的誘導率均為最強，且不易于褐化；相比之下１／２ＭＳ培養基誘導的愈傷組織結構致密、生長緩慢、褐化嚴重，不利于誘導出疏松的愈傷組織［１０］。

２．２ 增殖培養基

關于繼代培養的研究，何潑等［１１］在ＭＳ、Ｂ５、ＬＳ、Ｗｈｉｔｅ、１／２ＭＳ、Ｎ６培養基上進行繼代培養，結果表明，ＭＳ培養基雖然在誘導時效果很好，但它不適于愈傷組織的繼代培養，愈傷在接種到該培養基上后生長緩慢，增長率較低，有的接種后不久會褐化死亡；而Ｂ５培養基最適合于愈傷組織的繼代培養，繼代后愈傷組織生長旺盛，增長率最高；此外Ｎ６培養基的效果也較好。但據黃勇等［12］報道，ＭＳ培養基更適合于杜仲愈傷組織的繼代培養，這可能是由于培養基上所加生長調節物質有所不同，或者與外植體種類也有一定的關系。另有李琰等［１］以ＭＳ、ＬＳ、Ｂ５、Ｎ６、Ｈ、Ｎｉｔｓｃｈ、Ｗｈｉｔｅ、ＷＰＭ為基本培養基，進行不同培養基對杜仲嫩莖及幼葉愈傷組織誘導的研究；以ＭＳ、ＬＳ、Ｂ５、Ｎ６、Ｈ、Ｎｉｔｓｃｈ、Ｗｈｉｔｅ、１／２ＭＳ為基本培養基，進行不同培養基對杜仲嫩莖及幼葉愈傷組織繼代培養的研究。結果表明，ＭＳ培養基有利于杜仲幼莖愈傷組織的誘導，而Ｂ５培養基不僅對葉的愈傷組織誘導有利，對莖和葉愈傷組織的繼代培養也是最理想的。

３ 激素的選擇

３．１ 愈傷組織的誘導和增殖

試驗表明，沒有添加植物激素的培養基上，杜仲愈傷組織繼代生長很差，單獨使用ＮＡＡ的生長速度不如ＮＡＡ與ＢＡ配合使用。ＢＡ的最優使用量范圍為１．０～３．０ ｍｇ／Ｌ，ＮＡＡ的最優使用量范圍為０．５～４．０ ｍｇ／Ｌ。比較可見，在以ＭＳ培養基（０．８％瓊脂＋３％蔗糖）上附加２．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ有利于杜仲愈傷組織的誘導；以Ｂ５培養基（０．８％瓊脂＋３％蔗糖）上附加１．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ，有利于愈傷組織的增殖［１１］。據黃勇等［１２］的報道，以杜仲幼莖為外植體，接種于附加ＮＡＡ、２，４－Ｄ、ＫＴ、６－ＢＡ及其組合的ＭＳ培養基上，均能產生愈傷組織，但附加２，４－Ｄ的培養基上愈傷組織容易褐化，其他均可正常生長，附加０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋ １．０ ｍｇ／Ｌ ＫＴ的培養基適合愈傷組織的增殖培養。

３．２ 芽的誘導和增殖

芽的誘導形成使用的激素有ＢＡ、ＮＡＡ、ＩＢＡ、ＢＡＰ、ＩＡＡ、ＫＴ等，ＢＡ和ＮＡＡ 2種激素在從愈傷上誘導芽時通常需要混合使用，ＢＡ的最優使用量范圍為０．５0～２．２５ ｍｇ／Ｌ，ＮＡＡ的最優使用量范圍為０．０５～０．５0 ｍｇ／Ｌ［８］。

根據李巖等［５］的報道，在含有０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋ ０．８ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ的ＭＳ培養基中，杜仲胚軸可直接誘導產生不定芽，誘導率達到４７％，為較優培養方案。李琰等［2］以ＭＳ為基本培養基，在添加０．０５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＢＡ或者０．１ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＢＡ的培養基中，腋芽的誘導和生長較好；繼代增殖培養以０．５ ｍｇ／Ｌ ＢＡ＋０．０１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ的ＭＳ培養基叢芽數量最多，增殖系數最高。可見，不同濃度的ＢＡ和ＮＡＡ混合使用對芽的誘導與增殖有顯著促進作用。

３．３ 根的誘導

杜仲生根培養所需激素有ＮＡＡ、ＩＢＡ、ＧＡ等３種激素，以ＩＢＡ的效果最好，其適合濃度為１．５～２．０ ｍｇ／Ｌ［８］。據報道，只用Ｗｈｉｔｅ培養基，不添加激素也可以生根［８］。李巖等［５］研究表明，在生根培養中，附加１．５ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ＋２０ ｇ／Ｌ蔗糖的１／２ＭＳ培養基效果最好，生根率達到９１．７％。另有王東良等［４］報道，以１／３ＭＳ附加０．１ ｍｇ／Ｌ ＫＴ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ也有生根現象，生根率１８％。比較可知，采用１／２ＭＳ培養基材料的生根率明顯高于采用１／３ＭＳ培養基材料的生根率，且較低濃度的鹽離子有利于根的分化。

４ 光照條件

光對愈傷組織的生長既有促進作用也有抑制作用，杜仲的愈傷組織培養中，光照條件以１２ ｈ光照１２ ｈ暗培養最好。黑暗中和１２ ｈ光照條件下愈傷組織的增長量相似，但顏色差異較大。在生理生化特征和分化能力上這些形態不同的愈傷組織也有很大的差異，其在次生代謝產物的含量方面是否有差異尚需進一步研究［１３］。何潑等［１１］分別采取黑暗２４ ｈ／ｄ、光照１２ ｈ／ｄ、自然光３種不同光照方法進行光照對愈傷組織增長影響的試驗，結果表明，３種不同光照方式下愈傷組織的增長率并無太大差異，但光照１２ ｈ／ｄ條件下培養的愈傷組織更易做進一步的繼代培養，而連續黑暗培養２４ ｈ／ｄ時的增長率略低。

另外光照對杜仲愈傷中次生代謝物的積累有明顯影響，楊振堂等［１４］報道，光照有利于愈傷中杜仲膠的積累，與自然光下相比，杜仲膠的總生產率較高。另據李琰等［１５］的報道，黑暗不影響愈傷組織的生長，但卻抑制綠原酸和總黃酮的形成，光照１２ ｈ／ｄ對愈傷組織的生長及綠原酸和總黃酮的合成有明顯的促進作用。

５ 其他理化條件

５．１ 培養基ｐＨ對愈傷組織繼代培養的影響

培養基的ｐＨ可通過影響培養物對營養元素的吸收、呼吸代謝、ＤＮＡ合成、植物激素進出細胞等直接或間接地影響愈傷組織形成。培養基的ｐＨ因培養材料的來源不同，大多數植物都要求在ｐＨ ５．６～５．８的條件下進行培養，但不同的植物其最適ｐＨ也不一樣。

在杜仲愈傷組織誘導中發現，ｐＨ ４．８～６．８的誘導率差異不大，均在９０％以上，但對愈傷組織的長勢影響差異較大，只有ｐＨ ６．３時愈傷組織長勢最好，２０ ｄ的增長率可達１００％，過高或過低都起抑制作用［９］。

５．２ 碳源對杜仲愈傷組織繼代培養的影響

培養基中糖不僅起到碳源的作用，而且還有調節滲透的作用，因而對愈傷組織的生長和次生代謝產物的含量有明顯影響。據李琰等［１３］報道，以市售食用白糖、分析純的蔗糖、葡萄糖作為碳源，３種糖中以分析純的蔗糖最好，葡萄糖最差。白糖和蔗糖雖然主要成分都是蔗糖，但純度不同，白糖效果不如蔗糖，可能是因為白糖中微量雜質如重金屬、氯化物等對細胞生長和次生代謝產物的形成都有一定的抑制作用。高濃度的蔗糖能提高培養基中次生代謝產物的含量，其原因之一是提高了培養基的滲透壓。在１0～４0 ｇ／Ｌ蔗糖濃度范圍內，愈傷組織的增長量和次生物質的積累隨蔗糖濃度的升高而增加，在40 ｇ／Ｌ時愈傷組織增長量和黃酮含量達到最大值；蔗糖濃度50 ｇ／Ｌ時，愈傷組織的生長受到抑制，黃酮含量和產量也下降，但綠原酸的含量和產量仍在提高［１５］。

６ 杜仲組織培養及植株再生存在的問題

６．１ 初代的污染

杜仲組織培養在使用莖尖和帶芽莖段進行初代培養時污染率很高。據羅麗等［１６］報道，以４、５月份取材萌發率高，污染小。外植體最佳表面消毒方法為：３％Ｈ２Ｏ２浸泡２０ ｍｉｎ后，０．１％ ＨｇＣｌ２ ＋數滴Ｔｗｅｅｎ８０浸泡１０ ｍｉｎ。培養基附加鏈霉素８萬單位／Ｌ＋山梨酸鉀５０ ｍｇ／Ｌ抑制微生物生長。在培養１０～１５ ｄ受到污染時可浸泡于８萬單位／Ｌ鏈霉素１０ｍｉｎ或０．１％ ＨｇＣｌ２ ５ ｍｉｎ除菌。前１０ ｄ沒有出現污染，１０～１５ ｄ時微生物污染發生率在２０％以下。

６．２ 誘導芽困難

目前獲得成功的杜仲組織培養，大多以器官直接發生途徑獲得無菌芽，這雖然在一定程度上提高了組織培養效率，但增殖率仍然很低，一般為３～５個，無法達到產業化生產的標準。在杜仲組織培養中相比較根的誘導，芽的誘導相對較低，如何克服這一關鍵問題，是目前杜仲組織培養應用于生產上亟待解決的問題之一［８］。

６．３ 繼代培養中的褐化現象

在植物細胞培養特別是木本植物細胞培養中，愈傷組織在繼代培養中容易產生褐化，導致難以獲得生長旺盛、目的次生代謝產物含量高的細胞株于杜仲本身的生物學特性，導致杜仲組織培養過程中極易發生褐變現象，輕者影響細胞生長和繁殖，重者導致細胞死亡。據邱曉芳等［１７］的研究報道，以Ｂ５培養基０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ是杜仲愈傷組織繼代培養和褐化控制的適合培養基；另外，培養基中添加０．５％活性炭（ＡＣ）能有效地抑制杜仲愈傷組織的褐化；在光照條件方面，與中強光和紅光相比，藍光和黑暗能減輕組織的褐化。

參考文獻：

［１］ 李 琰，姜在民，唐 銳． 杜仲葉片愈傷組織誘導的激素優化研究［Ｊ］． 植物研究，２００６，２６（２）：１８２－１８６．

［２］ 李 琰，張 靖，辛轉霞，等． 杜仲組培快繁的研究［Ｊ］． 西北農林科技大學學報（自然科學版），２００４，３２（６）：７９－８２．

［３］ 李俊紅，張煥玲，李周岐． 杜仲組織培養再生體系的優化［Ｊ］． 西北林學院學報，２００８，２３（４）：９７－１００．

［４］ 王東良，丁 蘭，魏昊進． 杜仲組織離體培養研究［Ｊ］． 西北師范大學學報（自然科學版），２００４，４０（１）：６４－６６．

［５］ 李 巖，羅 麗，趙德剛． 杜仲胚軸、子葉直接誘導不定芽及再生體系的建立［Ｊ］． 中草藥，２００７，３８（１）：１０１－１０５．

［６］ 王慧英． 影響植物愈傷組織形成的因素研究［Ｊ］． 聊城大學學報（自然科學版），２０１０，２３（２）：５１－５３．

［７］ 羅 麗，趙德剛． 杜仲愈傷組織誘導與繼代培養研究［Ｊ］． 安徽農業科學，２００９，３７（７）：２８６１－２８６３，３０１９．

［８］ 唐 亮，金曉玲． 杜仲組織培養的研究進展［Ｊ］． 貴州農業科學，２０１０，３８（３）：１５－１８．

［９］ 李 琰，張朝紅，崔宏安，等． 杜仲愈傷組織誘導的研究［Ｊ］． 西北農林科技大學學報（自然科學版），２００３，３１（５）：１５３－１５６．

［１０］ 邱曉芳，朱 篤，張志斌，等． 杜仲疏松愈傷組織誘導條件的優化篩選［Ｊ］． 食品科學，２００６，２７（１１）：３７５－３７７．

［１１］ 何 潑，申 延，秦俊哲， 等． 杜仲愈傷組織誘導與增殖的研究［Ｊ］． 陜西科技大學學報（自然科學版），２００６，２４（２）：２１－２５．

［１２］ 黃 勇，周吉源． 杜仲愈傷組織的誘導及增殖效應［Ｊ］． 華中師范大學學報（自然科學版），２００３，３７（１）：１０２－１０５．

［１３］ 李 琰，王冬梅，崔宏安，等． 不同因子對杜仲愈傷組織繼代培養的研究［Ｊ］． 西北林學院學報，２００４，１９（１）：６１－６３．

［１４］ 楊振堂，臧 埔，馬淑琴，等． 杜仲組織培養中培養條件與含膠量關系的研究［Ｊ］． 特產研究，１９９９，２（２）：６－９．

［１５］ 李 琰，王冬梅，姜在民，等． 培養基及培養條件對杜仲愈傷組織生長及次生代謝產物含量的影響［Ｊ］． 西北植物學報，２００４，２４（１０）：１９１２－１９１６．

［１６］ 羅 麗，趙德剛． 杜仲帶芽莖段快速繁殖中的污染及控制［Ｊ］． 連云港師范高等專科學校學報，２００７，２（２）：７８－８０．

［１７］ 邱曉芳，朱 篤，張志斌，等． 杜仲愈傷組織繼代培養及抑制褐化的研究［Ｊ］．食品科學，２００７，２８（８）：３０７－３０９．