基于cry1Ac表達調控元件的蘇云金芽孢桿菌表達載體構建

摘要：通過克隆ｃｒｙ１Ａｃ基因ＢｔＩ－ＢｔＩＩ啟動子、ＳＤ序列以及終止子，并引入ｐＥＴ２８ａ的Ｈｉｓ標簽和多克隆位點，在穿梭載體ｐＨＴ３０４的基礎上構建了一個蘇云金芽孢桿菌表達載體ｐＢＭＢ１Ａ。將ｃｒｙ１Ａｃ以及具有非典型ＢｔＩ－ＢｔＩＩ啟動子的ｃｒｙ２Ａｂ、ｃｒｙ５Ｂａ、ｃｒｙ６Ａａ、ｃｒｙ７Ｂａ、ｃｒｙ５５Ａａ ６個基因裝載到該表達載體上，轉入BMB171構建了重組菌株，通過復紅簡單染色后的顯微鏡鏡檢結果表明，重組菌株BMB1A-1Ac、BMB1A-5Ba、BMB1A-7Ba和BMB1A-55Aa均能形成正常晶體，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果也證實這４個重組菌株的重組質粒均能表達出目的蛋白。同時，選取重組菌株BMB1A-1Ac來考察Ｈｉｓ標簽對Ｃｒｙ１Ａｃ殺蟲活性的影響，生物活性測定結果顯示重組菌株的ＬＣ５０值與對照菌株相比無明顯差異。該載體可用于快速克隆表達不同類別的Ｃｒｙ蛋白。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；表達載體；ｃｒｙ基因；ＢｔＩ－ＢｔＩＩ啟動子

中圖分類號：Ｑ７８２；Ｑ９３９．９６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）02－0400-06

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ

Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｃｒｙ１Ａｃ Gｅｎｅ

ＺＨＥＮＧ Ｗｅｎ，ＹＥ Ｗｅｉ－ｘｉｎｇ，ＰＥＮＧ Ｄｏｎｇ－ｈａｉ，ＳＵＮ Ｍｉｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，

Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｎａｍｅｄ ｐＢＭＢ１Ａ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ＢｔＩ－ＢｔＩＩ ｐｒｏｍｏｔｅｒ， ＳＤ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｏｆ ｃｒｙ１Ａｃ ｇｅｎｅ， ａｎｄ ａｄｄｉｎｇ Ｈｉｓ－ｔａｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓ （ＭＣＳ） ｆｒｏｍ ｐＥＴ２８ａ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｐＨＴ３０４． Ｃｒｙ１Ａｃ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｉｖｅ ｃｒｙ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ａｔｙｐｉｃａｌ ＢｔＩ－ＢｔＩＩ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｃｒｙ２Ａｂ， ｃｒｙ５Ｂａ， ｃｒｙ６Ａａ， ｃｒｙ７Ｂａ， ｃｒｙ５５Ａａ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＢＭＢ１Ａ． Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Cｒｙ１Ａｃ， Cｒｙ５Ｂａ， Cｒｙ７Ｂａ ａｎｄ Cｒｙ５５Ａａ ｃｏｕｌｄ ｆｏｒｍ ｐａｒａｓｐｏｒａｌ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ； Aｎｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅｍ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｍａｊｏｒ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ｃｒｙｓｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂａｎｄｓ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， Cｒｙ１Ａｃ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｉｓ－ｔａｇ ｏｎ ｉｔｓ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ ｔｈｅ ｂｉｏａｓｓａｙ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ＬＣ５０ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｉｎ． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｒｙ ｇｅｎｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ； ｃｒｙ ｇｅｎｅ； ＢｔＩ－ＢｔＩＩ ｐｒｏｍｏｔｅｒ

蘇云金芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂｔ），是一種革蘭氏陽性土壤芽孢桿菌，屬于蠟狀芽孢桿菌群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ Ｇｒｏｕｐ），在形成芽孢的同時，菌體內會產生不同形狀的伴胞晶體蛋白，稱為殺蟲晶體蛋白［１］，簡稱Ｃｒｙ蛋白。Ｃｒｙ蛋白的殺蟲活性使以Ｂｔ為主要成分的生物殺蟲劑得到了廣泛應用，同時Ｂｔ也是轉基因資源的一種重要的基因來源。Ｂｔ產品的持續使用引發了人們對于昆蟲抗性的憂慮，研究者采用多種策略來延緩或者克服抗性，如使用多種Ｃｒｙ毒素、生物避難所以及高劑量或次高劑量的毒素［２］。而新基因的克隆和表達仍然是Ｂｔ研究領域的一個熱點。截至２０１１年５月５日，Ｃｒｙ蛋白編碼基因已增至６８群５７０種ｃｒｙ基因和３群３５種ｃｙｔ基因（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ）。

近年來，快速發展的第二代測序技術產生了大量的Ｂｔ基因組序列，加快了研究者對Ｃｒｙ蛋白編碼基因資源的發掘。然而從這些基因組序列中快速地克隆、表達Ｃｒｙ蛋白編碼基因并不容易。其難點在于第二代測序技術產生的序列相對比較短，很多Ｃｒｙ蛋白編碼基因的序列信息不完整，對那些僅包含完整開放閱讀框（ＯＲＦ），而啟動子和終止子序列不完整的ｃｒｙ基因的表達是相當繁瑣的。同時在Ｂｔ中，有部分ｃｒｙ基因利用自身啟動子無法表達，則需要替換成其他ｃｒｙ基因的啟動子。還有將ｃｒｙ基因裝載到大腸桿菌表達載體中進行表達的，但是不能形成正常的晶體而是產生包涵體。也有利用ｃｒｙ基因的啟動子及其調控元件進行其他單個基因的表達（如ｃｒｙ，ｖｉｐ，ａｉｉＡ等），但是利用同一載體進行多個不同類型ｃｒｙ基因的表達則未見報道［３］。

蘇云金芽孢桿菌Ｃｒｙ蛋白的表達涉及許多因素，如ｃｒｙ基因啟動子活性、ｍＲＮＡ穩定性、不同ｃｒｙ基因的協同表達以及伴胞晶體的形成等方面［４］。ＢｔＩ－ＢｔＩＩ啟動子是蘇云金芽孢桿菌Ｃｒｙ蛋白編碼基因最為普遍、典型的一類強啟動子，許多ｃｒｙ基因，除ｃｒｙ１Ａ，ｃｒｙ１Ｂ、ｃｒｙ２Ａ、ｃｒｙ４Ａ、ｃｒｙ４Ｂ以及位于操縱子中的ｃｒｙ１１Ａａ、ｃｒｙ１５Ａａ都含有一個啟動子ＢｔＩ或雙啟動子ＢｔⅠ－ＢｔⅡ［４］。另外，很多ｃｒｙ基因的轉錄終止子含有反向重復序列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ－ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＩＲＳ），富含ＧＣ且能夠形成穩定的莖環結構（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ），它通過阻止３′－５′核酸外切酶對ｍＲＮＡ的降解，增加ｃｒｙ基因ｍＲＮＡ的穩定性，從而促進ｃｒｙ基因的表達［５，６］。通過比較不同ｃｒｙ基因轉錄終止子的結構發現，許多ｃｒｙ基因如ｃｒｙ１、ｃｒｙ２Ａｂ、ｃｒｙ３Ａ、ｃｒｙ４Ｂａ、ｃｒｙ７Ｂａ１等的終止區含有一個反向重復序列，說明這種結構普遍存在于Ｂｔ中［３］。

本研究利用ｃｒｙ１Ａｃ基因表達調控元件構建一個可快速克隆表達不同類別Ｃｒｙ蛋白的通用載體，以加速新型Ｃｒｙ蛋白編碼基因的發掘與利用。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 菌株與質粒 實驗采用的菌株與質粒信息見表１。

１．１．２ 培養基 ＬＢ培養基：蛋白胨１０ g/L，酵母粉５ g/L，ＮａＣｌ １0 g/L，ｐＨ ７．０～７．２；固體培養基加瓊脂１６ g/L。ＩＣＰＭ培養基：蛋白胨６ g/L，葡萄糖５ g/L，ＣａＣＯ３ １ g/L，ＭｇＳＯ４ ０．５ g/L，ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ g/L，ｐＨ ７．０；固體培養基加瓊脂１６ g/L。大腸桿菌在３７°Ｃ ＬＢ培養基中培養；蘇云金芽孢桿菌在２８°Ｃ ＩＣＰＭ培養基中培養。在上述相應培養基中加入抗生素，用于轉化子的篩選或重組菌株的培養。各抗生素終濃度為，氨芐青霉素（Ａｍｐ）：１００ μｇ／ｍＬ；紅霉素（Ｅｒｍ）：２５ μｇ／ｍＬ；卡那霉素（Ｋａｎ）：５０ μｇ／ｍＬ。

１．１．３ 酶和試劑 各種限制性內切酶、Ｔ４ ＤＮＡ連接酶、Ｆａｓｔ ｐｆｕ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、各種ＤＮＡ分子量標準等均為ＴａＫａＲａ公司產品，蛋白質分子量標準ＳＭ０６６１為Ｐｒｏｍｅｇａ公司產品；其他主要生化試劑購自上海生工生物工程有限公司、武漢天源生物科技公司。ＰＣＲ引物合成由上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司完成，測序由北京奧科生物公司完成。

１．１．４ ＰＣＲ引物 實驗所用引物序列和相應的功能見表２。

１．２ 方法

ＤＮＡ操作：質粒的提取、酶切、凝膠電泳、回收純化、連接、常規轉化大腸桿菌ＤＨ５α以及ＰＣＲ反應，均參照文獻［７］的方法。蘇云金芽孢桿菌的感受態細胞的制備，參照文獻［８］的方法。蘇云金芽孢桿菌的電轉化，參照文獻［９］的方法。Ｃｒｙ蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，參照文獻［１０］的方法。蘇云金芽孢桿菌的復紅簡單染色，參照文獻［１１］的方法。生物測定：以棉鈴蟲（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）初孵幼蟲為供試昆蟲，參照文獻［１２］的方法。

２ 結果與分析

２．１ 表達載體ｐＢＭＢ１Ａ的構建

載體的構建示意圖見圖１。以ＹＢＴ－１５２０總ＤＮＡ為模板，擴增得到ｃｒｙ１Ａｃ終止子，經Ｋｐｎ Ｉ和ＥｃｏＲⅠ雙酶切插入到穿梭載體ｐＨＴ３０４上，得到載體ｐＨＴ３０４－Ｔ。以兩者之間有２０個堿基重疊互補的ＰＢ１Ａ２、ＰＢ１Ａ３為內引物，先分別以ＹＢＴ－１５２０總ＤＮＡ為模板、質粒ｐＥＴ２８ａ為模板，擴增得到ｃｒｙ１Ａｃ啟動子序列（BtⅠ-BtⅡ啟動子）、Ｈｉｓ標簽及其后的多克隆位點（MCS），將兩個片段純化后混合作為模板，并以ＰＢ１Ａ１、ＰＢ１Ａ４為引物對用ＳＯＥ法擴增，得到ｃｒｙ１Ａｃ啟動子與ｐＥＴ２８ａ的編碼區從ＡＴＧ定點連接。再經ＳｐｈⅠ和ＫｐｎⅠ雙酶切插入到載體ｐＨＴ３０４－Ｔ上，轉化并對轉化子抽提質粒，酶切驗證正確后，將此構建的表達載體命名為ｐＢＭＢ１Ａ（圖２）。

２．２ 不同類別ｃｒｙ基因重組質粒的構建

以ＹＢＴ－１５２０總ＤＮＡ為模板，擴增得到ｃｒｙ１Ａｃ和ｃｒｙ２Ａｂ的完整ＯＲＦ。以ＹＢＴ－１５１８總ＤＮＡ為模板，擴增得到ｃｒｙ５Ｂａ、ｃｒｙ６Ａａ和ｃｒｙ５５Ａａ的完整ＯＲＦ。以ＹＢＴ－９７８總ＤＮＡ為模板，擴增得到ｃｒｙ７Ｂａ的完整ＯＲＦ。ｃｒｙ１Ａｃ片段經Ｂａｍ ＨⅠ和ＳａｌⅠ雙酶切，其余片段均經Ｂａｍ ＨⅠ和ＸｈｏⅠ雙酶切，插入到載體ｐＢＭＢ１Ａ多克隆位點處得到重組質粒ｐＢＭＢ１Ａ－１Ａｃ、 ｐＢＭＢ１Ａ－２Ａｂ、 ｐＢＭＢ１Ａ－５Ｂａ 、ｐＢＭＢ１Ａ－６Ａａ、ｐＢＭＢ１Ａ－７Ｂａ、ｐＢＭＢ１Ａ－５５Ａａ，轉化之后對轉化子進行酶切驗證，結果正確（圖３）。以上質粒電轉化ＢＭＢ１７１，挑取正確轉化子，得到重組菌株ＢＭＢ１Ａ－１Ａｃ、ＢＭＢ１Ａ－２Ａｂ、ＢＭＢ１Ａ－５Ｂａ、ＢＭＢ１Ａ－６Ａａ、ＢＭＢ１Ａ－７Ｂａ、ＢＭＢ１Ａ－５５Ａａ。

２．３ 重組菌株的晶體形成及蛋白表達檢測

重組菌株ＢＭＢ１Ａ－１Ａｃ、ＢＭＢ１Ａ－２Ａｂ、ＢＭＢ１Ａ－５Ｂａ、ＢＭＢ１Ａ－６Ａａ、ＢＭＢ１Ａ－７Ｂａ、ＢＭＢ１Ａ－５５Ａａ以及對照菌株ＢＭＢ１Ａ、ＢＭＢ３０４－１Ａｃ、ＢＭＢ３０４－５Ｂａ、ＢＭＢ３０４－６Ａａ、 ＢＭＢ３０４－７Ｂａ、 ＢＭＢ３０４－５５Ａａ在ＩＣＰＭ固體平板上培養７２ ｈ后，刮取菌體進行復紅簡單染色。顯微鏡鏡檢發現，ＢＭＢ１Ａ－１Ａｃ可以產生明顯的菱形晶體，與對照菌株ＢＭＢ３０４－１Ａｃ一致。ＢＭＢ１Ａ－５Ｂａ和ＢＭＢ１Ａ－７Ｂａ也能產生大量菱形晶體，與利用自身啟動子表達的對照菌株ＢＭＢ３０４－５Ｂａ和ＢＭＢ３０４－７Ｂａ一致。重組菌株ＢＭＢ１Ａ－５５Ａａ可以產生長米粒形晶體，與對照菌株ＢＭＢ３０４－５５Ａａ相同。另外，在重組菌株ＢＭＢ１Ａ－２Ａｂ和ＢＭＢ１Ａ－６Ａａ上未觀察到晶體的形成，但是對照菌株ＢＭＢ３０４－６Ａａ利用自身啟動子能夠表達米粒形晶體（圖４）。

之后，收集重組菌株ＢＭＢ１Ａ－１Ａｃ、ＢＭＢ１Ａ－２Ａｂ、 ＢＭＢ１Ａ－５Ｂａ、 ＢＭＢ１Ａ－６Ａａ、 ＢＭＢ１Ａ－７Ｂａ 、ＢＭＢ１Ａ－５５Ａａ以及對照ＢＭＢ１Ａ、ＢＭＢ３０４－１Ａｃ菌體，進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測。結果顯示ＢＭＢ１Ａ－１Ａｃ產生約１３０ｋＤ的蛋白帶，與正對照ＢＭＢ３０４－１Ａｃ一致。ＢＭＢ１Ａ－５Ｂａ產生約１４０ｋＤ的蛋白帶、ＢＭＢ１Ａ－７Ｂａ產生約１３０ｋＤ的蛋白帶、ＢＭＢ１Ａ－５５Ａａ產生約４５ｋＤ的蛋白帶，與預期結果一致。而沒有觀察到晶體形成的ＢＭＢ１Ａ－２Ａｂ沒有預期的約７０ｋＤ的蛋白帶，同樣，ＢＭＢ１Ａ－６Ａａ也沒有５４ｋＤ的蛋白帶產生（圖５）。

２．４ 重組菌株的生物活性測定

重組菌株ＢＭＢ１Ａ－１Ａｃ和對照菌株ＢＭＢ３０４－１Ａｃ在ＩＣＰＭ液體培養基中培養４８ ｈ后收集發酵液。取樣進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳確定伴胞晶體蛋白濃度。然后將發酵液做兩倍梯度稀釋，以棉鈴蟲初孵幼蟲進行生物活性測定。重組菌株ＢＭＢ１Ａ－１Ａｃ的ＬＣ５０值為１０．１ ｎｇ／ｍＬ，與對照菌株ＬＣ５０值１６．０ ｎｇ／ｍＬ相比無明顯差異（表３）。

３ 討論

蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白的表達涉及許多因素，利用一些促進蛋白表達的調控機制：轉錄水平（芽孢依賴型強啟動子ＢｔＩ－ＢｔＩＩ），轉錄后水平（ＳＴＡＢ－ＳＤ序列、３′端莖環結構強終止子）以及翻譯水平（ＳＤ序列），構建了一個蘇云金芽孢桿菌表達載體ｐＢＭＢ１Ａ。進一步將ｃｒｙ１Ａｃ以及具有非典型ＢｔＩ－ＢｔＩＩ啟動子的ｃｒｙ２Ａｂ、ｃｒｙ５Ｂａ、ｃｒｙ６Ａａ、ｃｒｙ７Ｂａ、ｃｒｙ５５Ａａ ６個基因裝載到該表達載體上，轉入BMB171構建了重組菌株，通過復紅簡單染色后的顯微鏡鏡檢結果表明重組菌株BMB1A-1Ac、BMB1A-5Ba、BMB1A-7Ba和BMB1A-55Aa均能形成正常晶體，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果也證實這４個重組菌株對應的重組質粒均能表達出目的蛋白。同時，選取重組菌株BMB1A-1Ac來考察Ｈｉｓ標簽對Ｃｒｙ１Ａｃ殺蟲活性的影響，生物活性測定結果顯示重組菌株的ＬＣ５０值與對照菌株相比無明顯差異。

在蘇云金芽孢桿菌中，合成的大分子量Ｃｒｙ蛋白（１３０～１４０ｋＤ）如Ｃｒｙ１和Ｃｒｙ４等，由于具有與蛋白毒性無關但又富含半胱氨酸的Ｃ－半段，通過其分子間二硫鍵能自動正確組裝形成伴胞晶體［１３］。另外Ｃｒｙ１蛋白的Ｃ－半段不僅影響晶體形成，而且可以提高Ｃｒｙ２Ａａ和Ｃｒｙ３Ａａ蛋白的表達量［３］。正因為如此，利用本載體表達大分子量的Cｒｙ１Ａｃ、Cｒｙ５Ｂａ、Cｒｙ７Ｂａ，仍能夠形成正常的菱形晶體，而且對于小分子量的Cｒｙ５５Ａａ也能形成正常的長米粒形晶體。另外，已有研究發現，輔助蛋白ｐ１９、ｐ２０、ＯＲＦ１和ＯＲＦ２等能有效促進Ｃｒｙ蛋白編碼基因的表達和伴胞晶體的形成［１４］，例如ｃｒｙ２Ａ和ｃｒｙ２Ｃ上游都含有ＯＲＦ１和ＯＲＦ２兩個開放閱讀框，它們與ｃｒｙ２基因位于同一個操縱子中［１５］，而Crickmore等認為cｒｙ２Ａａ的表達及晶體的形成必須有ＯＲＦ２的參與［１６］。實驗表達ｃｒｙ２Ａｂ基因也未能成功，很可能是因為缺少ＯＲＦ１和ＯＲＦ２的幫助。另外ｃｒｙ６Ａａ基因未能成功表達，有報道是因為位于ｃｒｙ６Ａａ基因下游的ＯＲＦ２負調控晶體蛋白編碼基因的表達［１７］，猜測ｃｒｙ６Ａａ有可能需要其他基因的調控作用，也可能該基因具有自身啟動子的特異性，利用其他類型啟動子無法表達。

利用ｃｒｙ１Ａｃ基因表達調控元件構建了一個表達載體，經驗證，該載體適用于不同類別ｃｒｙ的表達。該載體可快速批量克隆表達出Ｃｒｙ蛋白，加速新型殺蟲晶體蛋白基因的發掘和利用。今后將對載體進行優化，擴大該載體的應用范圍，比如在載體上插入輔助蛋白基因等，以利于那些需要輔助蛋白參與的晶體蛋白的表達。

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