黑曲霉粗酶液對苦杏仁苷的生物轉化研究

摘要：為篩選到新型具有抗腫瘤活性轉化產物，采用酶催化轉化的方法對苦杏仁苷進行了生物轉化研究。ＨＰＬＣ分析表明，苦杏仁苷在黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）全細胞酶的作用下生成了４個產物，并采用ＭＳ和ＮＭＲ法對產物的結構進行了鑒定。

關鍵詞：黑曲霉；苦杏仁苷；生物轉化；結構鑒定

中圖分類號：Ｏ６５５．４；Ｑ５５６＋．２ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）02－0377-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｙｇｄａｌｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Cｒｕｄｅ Eｎｚｙｍｅ Eｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ

ＣＨＡＮＧ Ｊｕｎ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｉａｎｇｘｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００１３， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｓｏｍｅ ｎｅｗ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｓ ｏｆ ａｍｙｇｄａｌｉｎ， ａｍｙｇｄａｌｉｎ ｗａｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ Ａｓｐｇｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ． Ｔｈｅ ＨＰＬＣ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｍｙｇｄａｌｉｎ ｗａｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｄ ｉｎｔｏ ｆｏｕｒ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ＭＳ ａｎｄ ＮＭＲ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ； ａｍｙｇｄａｌｉｎ； ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ； ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

苦杏仁苷（Ａｍｙｇｄａｌｉｎ）屬苯乙醇腈的β－龍膽二糖苷，是苦杏仁中的主要有效成分之一，其結構見圖１。苦杏仁苷廣泛存在于杏、桃、李等多種薔薇科植物果實的種子中，具有良好的抗腫瘤［１］、抗氧化［２］、調節免疫功能［３］及鎮咳平喘的作用［４］。研究表明，由于苦杏仁苷在微生物、葡萄糖苷酶、酸或堿作用下水解產生的氫氰酸［５］可通過抑制線粒體電子傳遞鏈的終端酶——細胞色素氧化酶中斷ＡＴＰ的合成，導致腫瘤細胞死亡［６］，但另一方面，苦杏仁苷中的糖苷鍵在微生物發酵液、酸或堿性條件下極易降解為氫氰酸和苯甲醇，難以控制，所以通過黑曲霉粗酶液對苦杏仁苷進行了催化轉化，以期找到具有抗癌活性的新物質。

１ 材料與方法

１．１ 材料

苦杏仁苷由苦杏仁中分離純化得到，純度＞８５％，杏仁腈、苯由酸、野櫻苷均購自Ｓｉｇｍａ公司，純度＞９８％。色譜純甲醇購于Ｆｉｓｈｅｒ公司，其他均為分析純試劑。

１．２ 微生物菌株

黑曲霉為筆者所在實驗室保藏菌株，分離于土壤，４ ℃保存于ＰＤＡ斜面上，每兩月轉接１次保持其活力。

１．３ 黑曲霉粗酶制備

黑曲霉液體培養基含８ ｇ／Ｌ葡萄糖，５ ｇ／Ｌ蛋白胨，５ ｇ／Ｌ酵母膏， ５ ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４， ５ ｇ／Ｌ ＮａＣｌ， １ ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４ ·７Ｈ２Ｏ，１ ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４·４Ｈ２Ｏ，ｐＨ ６．５。黑曲霉孢子（１０７個／ｍＬ）接入無菌培養基后，置于２８ ℃，１６０ ｒ／ｍｉｎ振搖培養５ ｄ。收集發酵液，過濾，棄去菌絲體，上清液用飽和硫酸銨４ ℃下鹽析１２ ｈ，以１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ、４℃離心３０ ｍｉｎ，取沉淀。沉淀用少量去離子水溶解，脫鹽，冷凍干燥得粗酶，４ ℃冰箱保存備用。

１．4 苦杏仁苷催化轉化

取０．５ ｍＬ的１０ ｍｇ／ｍＬ苦杏仁苷溶液于２ ｍＬ的８２ Ｕ／ｍＬ（以β－葡萄糖苷酶活性計）的粗酶水溶液中，３７ ℃保溫反應４ ｈ。

１．5 ＨＰＬＣ分析

安捷倫１１００液相色譜系統，Ｃ１８反相色譜柱（２５０ ｍｍ × ４．６ ｍｍ），柱溫２８ ℃，流動相為體積分數為３０％的甲醇－水溶液，檢測波長２１０ ｎｍ，進樣量１０ μＬ。對照品配制成濃度為２ ｍｇ／ｍＬ，其他檢測條件相同。

１．6 酶解產物的分離和純化

反應完成后，先用等體積石油醚萃取酶解液３次，再用等體積氯仿萃取３次，收集氯仿萃取液，濃縮干燥，殘留物用甲醇溶解，再依次用大孔樹脂和硅膠柱進一步純化，大孔樹脂的洗脫液為氯仿－甲醇溶液，按照體積比１∶９～９∶１進行梯度洗脫，硅膠柱的洗脫液為甲醇－水溶液，按照體積比２∶８～６∶４進行梯度洗脫，收集組分后，冷凍干燥備用。

２ 結果與分析

２．１ 催化轉化結果

圖２為各種樣品的ＨＰＬＣ圖譜。對比圖２-Ａ、圖２-Ｂ和圖２-Ｃ可知，酶解反應４ ｈ后，在５．０８７ ｍｉｎ處沒有苦杏仁苷峰（圖２-Ｂ），這表明，苦杏仁苷發生了水解，而且在圖２-Ｂ中還出現了４個新峰，說明苦杏仁苷經水解后，產生了４個轉化產物。經過與杏仁腈、苯甲酸、野櫻苷標準品ＨＰＬＣ（譜圖未列出）對比，發現產物１、３、４分別與杏仁腈、野櫻苷和苯甲酸保留時間相同，因此可初步判斷產物１、３、４分別為杏仁腈、野櫻苷和苯甲酸。

２．２ 產物分離純化結果

發酵液經氯仿萃取后，產物２主要存在于氯仿層中，上層水溶液中僅有少量產物２。將氯仿層合并、旋轉蒸發濃縮，大孔樹脂洗脫，分析表明，產物２主要集中在氯仿－甲醇體積比為３∶７的洗脫組分中。收集該洗脫液，濃縮，并用硅膠柱洗脫，濃縮、干燥，產物２的純度達到９８％。該物質的理化鑒定結果如下：白色針狀結晶（ＣＨＣｌ３－ＭｅＯＨ），ｍｐ：１３７－１４０℃， ［α］２０Ｄ －３７．０（Ｃ ０．７６，ＣＨ３ＣＯＣＨ３）．ｖｍａｘ： ３ ４７０ ｃｍ－１； ＥＳＩ－ＭＳ ｍ/ｚ：３４１．２９８ ６［Ｍ＋Ｈ］＋， １３Ｃ－ＮＭＲ （ＣＤＣＯＣＤ３，１２５ ＭＨｚ）：δＣ １０６．７（Ｃ－ｌ’），６９．６ （Ｃ－２’），１１８．４（Ｃ－３’），１２５．３（Ｃ－４’），１０８．９（Ｃ－５’）， １５４．４（Ｃ－６’）．１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣＯＣＤ３， ５００ＭＨｚ）：δＨ ６．５７（２Ｈ，ｍ，Ｈ－５，７），７．０５（２Ｈ，ｍ，Ｈ－４，８）；δＨ ５．９１ （１Ｈ，ｓ，Ｈ－２），δＨ ４．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ， Ｈ－ｌ’）。經與文獻［７］對比后發現，產物２比野櫻苷在Ｃ－６上多了1個羥基，其化學結構式見圖３。

３ 討論

苦杏仁苷屬苯乙醇腈的β－龍膽二糖苷類化合物，在酸、堿性條件下不穩定。在分離苦杏仁苷的過程中，也會發生少量的降解。現有的苦杏仁苷相關研究主要集中在栽培、分離、毒性［８］及檢測［９，１０］等方面。描述苦杏仁苷具有腫瘤活性的報道稱，其活性主要由其降解產物氫氰酸對電子傳遞鏈的毒性導致腫瘤細胞死亡而實現。然而，也有報道稱苦杏仁苷并不具有抗腫瘤效果［１１］。因此，對苦杏仁苷的抗腫瘤活性及其相關機理還需要進一步研究。

本課題組在苦杏仁苷的生物轉化研究中發現，黑曲霉發酵液的酸性環境會影響苦杏仁苷的穩定性，為了降低酸性環境對苦杏仁苷的不利影響，應用黑曲霉粗酶提取液對苦杏仁苷進行了催化，結果表明，當排除酸性發酵環境的影響后，苦杏仁苷生成了新的產物６－ＯＨ－野櫻苷，其反應機制可能是苦杏仁苷在β－葡萄糖苷酶的作用下水解成苷元（野櫻苷），生成的苷元很容易在環境因素或其他酶的作用下進一步降解成杏仁腈和苯甲酸，如果能排除環境因素對苷元穩定性的影響，苷元能夠在羥基化酶的作用下進一步羥基化生成６－ＯＨ－野櫻苷。６－ＯＨ－野櫻苷是一新化合物，其抗腫瘤活性還需要進一步研究。

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