3730 DNA測序儀的使用和維護

【摘要】DNA序列測定是研究基因結構和功能的基礎。美國ABI公司生產的3730型DNA測序儀是一款高質量的長片段讀取和序列分析的測序平臺，在測序方面有諸多突出優點。儀器的日常維護和保養也是保證好的測序結果的重要因素。

【關鍵詞】DNA序列測定；PCR；維護

DNA序列測定是分子生物學領域最重要的技術之一，是了解基因結構和功能的基礎。DNA序列測定分手工測序和自動測序，而儀器自動化測序法以其快速、準確等優點成為當今DNA序列分析的主流。美國ABI公司生產的3730型DNA測序儀就是其中一款高質量的長片段讀取和序列分析的測序平臺，應用靈活而廣泛。基于Sanger法，ABI3730測序儀擁有48道毛細管，它采用毛細管電泳技術取代了傳統的聚丙烯酰胺平板電泳，以該公司專利的四色熒光染料標記的ddNTP法（即標記終止物法）來進行DNA測序反應。因此通過單引物PCR測序反應，生成的PCR產物則是相差1個堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。3730型DNA測序儀的優點表現在以下幾個方面：（1）大大提高了數據的產率，超高的光路靈敏度和優化的分離膠保證低成本地獲得高質量的基因序列分析數據；即使使用低濃度樣品和高倍稀釋的測序試劑，提高的信噪比也可保證獲得高質量的分析結果。（2）顯著改善的數據質量，大大降低的單一樣品分析成本使之每天可以分析更多的樣品，并極大的提升了分析能力。（3）高度可靠的多自動化設計使人工操作失誤的機會降至最低。（4）一臺儀器，多種應用。新的應用試劑和分析方法加上新型軟件使SNP位點發現和大規模SNP分型成為可能，可以開展一系列新的基因分析研究項目。3730型DNA測序儀雖然操作簡單易行，但影響測序質量的主要因素還包括模板、引物、PCR反應和測序產物的純化。

第一，DNA模板的純度。DNA測序所用的模板可以是質粒DNA，也可以是PCR產物，但使用高質量的模板是測序成功的前提。為了保證測序的成功率，質粒DNA和PCR產物一定要純化，且PCR產物純化后必須先進行1%瓊脂糖凝膠電泳（凝膠中含0.5mg/L溴化乙錠，樣品濃度為0.2g/L，上樣量為1μl）鑒定其純度，要求條帶清晰，無雜帶，無拖尾；質粒DNA要通過風光光度計測量其純度，排除RNA和蛋白質污染。否則，在測序結果中容易出現雙峰或雜峰；質粒DNA為非單克隆時，測序結果也會出現套峰。第二，引物。測序引物比PCR引物要求高，隨即引物和簡并引物不能用于測序，較長的引物也不適用，否則會造成結果信號極弱或者無信號；在測序反應中，引物的純度和特異性也非常重要。測序時只要單一引物，不能將雙向PCR引物混合，引物不純或引物特異性不好，測序結果會出現雙峰，套峰；引物存在二聚體現象時，測序結果前100多BP會有高噪音影響。第三，PCR反應是關鍵。測序反應是DNA自動測序的第一步，也是測序成敗的關鍵所在。符合測序要求的DNA模板，經過測序反應后，會形成數百條帶有不同熒光的核苷酸鏈，且每條核苷酸鏈的堿基數只相差1個堿基。目前，我們使用的測序試劑為ABI公司提供的DNA測序試劑盒（Dye-primer或Dye-ter-minator），其中每種試劑的濃度為產品的最佳組合，而且測序反應的條件（變性、退火、延伸的時間和溫度）與試劑盒配套使用。這就必須按照試劑盒的要求控制好模板的濃度，即使純度合格的DNA模板其濃度也很重要，單鏈DNA模板為0.10g/L，雙鏈質粒模板為0.20g/L，PCR產物根據其片段的長度取適當的量，濃度過高或過低都會直接影響測序的結果。根據我們的使用情況，濃度太高時，電泳條帶信號強，會出現平頭峰，測序結果短（一般＜250bp），而且誤差大；濃度過低時，電泳條帶信號弱，噪聲多，誤差大，可信度差。在使用Dye-termina-tor法測序時（一般模板為PCR產物），除模板的純度和濃度符合要求外，所用引物的純度和濃度也很重要，引物應為測序級純度，濃度應準確定量。模板與引物的比例以200ng：3.2pmol為宜，質粒量與引物量不平衡，會導致測序反應效率低，剩余的染料多，對于所有的化學和儀器，剩余的染料太多都將影響數據質量。第四，測序產物的純化。測序產物純化不夠，會產生染綠峰和酒精峰的干擾。染料峰一般位于序列的前100堿基以內；酒精峰位于序列的220～320堿基之間。除了以上因素外，3730測序儀良好的工作狀態也是保證測序獲得成功的必要條件。這就需要我們做好儀器的日常維護和保養。3730DNA測序儀熱量輸出約為1500W，實驗室要保證通風良好，否則要通過軟管連接儀器背部的激光風扇口，使用流量大于80fm的抽風機散熱；且儀器的擺放位置要避免陽光直射及正對空調的出風口；室內溫度要確保維持在15℃～21℃，濕度在20%～80%；實驗室內要配置UPS穩壓電源以保證供電良好。要定期清洗儀器各個部位：每一個月清洗一次pump和polymer block；每周沖洗一次水密封環；每三個月清潔一次毛細管外端的掃描窗口。嚴格按要求使用試劑等相關物品：每周更換一次測序膠，且在使用前置于室溫下半小時，待膠體清澈無沉淀時方可更換；每三天更換一次1X緩沖液和超純水。通過這些措施也可避免未知大分子熒光物質的污染，保證結果的準確性。