甲基化抑制劑對(duì)腎癌細(xì)胞株中γ-caenin蛋白表達(dá)的影響

【摘要】 目的 研究甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）對(duì)人腎癌A498細(xì)胞增殖及γ-連環(huán)蛋白（γ-catenin）表達(dá)的影響。方法 使用不同濃度（10-7、10-6、10-5 mol/L）的特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR處理A498腎癌細(xì)胞株。MTT檢測(cè)5-Aza-CdR對(duì)腎癌細(xì)胞株A498抑制作用。細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)5-Aza-CdR處理A498腎癌細(xì)胞株后γ-catenin表達(dá)的變化。結(jié)果 5-Aza-CdR能明顯抑制腎癌細(xì)胞的增殖，且與藥物濃度及作用時(shí)間有關(guān)。藥物處理后γ-連環(huán)蛋白表達(dá)增加。結(jié)論 γ-catenin蛋白表達(dá)受甲基化的抑制，提示5-Aza-CdR可使γ-catenin基因去甲基化而抑制A498腎癌細(xì)胞株增殖。

【關(guān)鍵詞】 5-氮雜-2-脫氧胞苷； 腎癌A498細(xì)胞株； γ-連環(huán)蛋白； 免疫組化

Expression of γ-catenin protein and its methylation regulation in human renal carcinoma line A498 TAO Mei-man，GUO Tao，SUN Hao.The affiliated hospital of jiangsu university，Zhenjiang 212001，China

【Abstract】 Objective To investigate the effect of methylation inhibitor 5-Aza-2-deoxycytidine on the growth of human renal cancer cell line A498 andγ-catenin expression.Methods Human renal carcinoma A498 cells were treated with different concentrations of 5-Aza-CdR（10-7，10-6，10-5 mol/L） respecttively.Then the growth rate of the cells was detected by MTT assay.The immuneocytochemistry was used to detectγ-catenin levels in the cell line before and after treatment with 5-Aza-CdR.Results 5-Aza-CdR can inhibit the growth of A498 cells，γ-catenin expression levels in A498 cells were increased after 5-Aza-CdR treatment.Conclusion γ-catenin expression levels were inhibited by methylation， 5-Aza-CdR can inhibit the growth of A498 cells by inducing demethylation in the promoter region ofγ-catenin gene.

【Key words】 5-Aza-2-deoxycytidine； A498 cell lines； γ-catenin； Immunocytochemistry

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腎細(xì)胞癌是人泌尿系統(tǒng)最常發(fā)生的惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤排在第二位，僅次于膀胱癌，占全身惡性腫瘤的3%^［1］。腎細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，抑癌基因失活是關(guān)鍵因素之一。研究表明，抑癌基因失活的主要方式有基因的缺失、突變和啟動(dòng)子區(qū)域的過甲基化等^［2］。γ-catenin是一種多功能蛋白質(zhì)。近年研究顯示，γ-catenin蛋白在多種腫瘤中表達(dá)減少。國外有研究證實(shí)，在腎癌組織及細(xì)胞其表達(dá)明顯下調(diào)^［3］，啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的過甲基化可能是其失活的主要方式，國內(nèi)尚無相關(guān)的報(bào)道。筆者采用5-氮-2-脫氧胞苷對(duì)腎癌細(xì)胞株進(jìn)行處理，檢測(cè)γ-catenin蛋白表達(dá)，進(jìn)一步研究腎癌細(xì)胞中γ-catenin蛋白表達(dá)下降是否與基因甲基化有關(guān)，探索增加或恢復(fù)腎癌細(xì)胞中γ-catenin蛋白正常表達(dá)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎癌細(xì)胞株A498購于上海細(xì)胞生物所，胎牛血清（杭州四季青）；DMEM培養(yǎng)基、胰酶、DAB顯色試劑盒及SABC試劑盒（sigma公司）；5-Aza-CdR（sigma公司），用PBS充分溶解后保存于-70 ℃冰箱備用；兔抗人γ-連環(huán)蛋白多克隆抗體、MTT及二甲亞楓（sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 將濃度分別為10-7、10-6、10-5 mol/L 5-Aza-CdR處理過的人腎癌細(xì)胞株A498分為三組，未經(jīng)5-Aza-CdR處理過的A498作為對(duì)照組。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人腎癌細(xì)胞株A498用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2 飽和濕度），隔日換液，細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶壁的80%～90%后，按照1：3傳代，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.3 MTT法測(cè)細(xì)胞增殖活性 對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以每孔5000個(gè)細(xì)胞密度接種于五塊96孔板中，過夜貼壁后，加入不同濃度的5-Aza-CdR，每孔180 μl，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)不加藥的對(duì)照孔和不接種細(xì)胞的調(diào)零孔。藥物和培養(yǎng)液每24 h更換1次，每天取出1板，加入5 g/L的MTT溶液20 μl，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min充分溶解結(jié)晶，置酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定波長490 nm下的光密度值，細(xì)胞生存率以平均光密度（D）值分析，以D值為縱坐標(biāo)，以時(shí)間（d）為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線圖。

1.2.4 細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)γ-catenin表達(dá) 采用細(xì)胞爬片法，按試劑盒說明采用ABC三步法。參照Bames等^［4］方法進(jìn)行半定量評(píng)分（分A、B兩項(xiàng)）：A項(xiàng)，按切片中細(xì)胞顯色深淺計(jì)分，0分為細(xì)胞無顯色，1分為顯淺黃色，2分為顯黃色，3分為顯棕黃色；B項(xiàng)，按顯色細(xì)胞的比例評(píng)分，1分為1%～30%，2分為31%～75%，3分為76%～100%。兩項(xiàng)指標(biāo)結(jié)合積分：陰性（-）積分為0分；陽性（+）積分為1～4分；強(qiáng)陽性（++）積分為5～6分。每組計(jì)數(shù)5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)數(shù)據(jù)組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，非正態(tài)數(shù)據(jù)組間兩兩比較采用Nemenyi法檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度5-Aza-CdR抑制A498細(xì)胞增殖的結(jié)果 MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR能抑制人腎癌細(xì)胞株A498增殖(圖1)，且與時(shí)間和藥物濃度有關(guān)。

2.2 細(xì)胞免疫組化結(jié)果 10-7、10-6、10-5 mol/L組間采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=228.92，P<0.01）。進(jìn)一步采用Nemenyi法兩兩比較，10-7 mol/L和10-6 mol/L組5-Aza-CdR比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 =252.16，P<0.01）；10-7 mol/L和10-5 mol/L組5-Aza-CdR比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 =396.48，P<0.01）；10-6 mol/L和10-5 mol/L組5-Aza-CdR比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.87，P<0.01）。表明經(jīng)甲基化抑制劑處理后γ-catenin表達(dá)增加，見表1。

3 討論

γ-catenin是一種多功能蛋白質(zhì)，分子量約為83 kD，基因定位于17q21上，參與由E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間黏附與信號(hào)傳導(dǎo)兩大功能。研究顯示，γ-catenin在非小細(xì)胞癌、乳腺癌^［5，6］等多種腫瘤中表達(dá)減少，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但其在腫瘤中表達(dá)下降的機(jī)制尚不清楚。研究表明，抑癌基因的失活和表達(dá)降低與其啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化狀態(tài)有關(guān)^［7，8］，而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平升高和活性增加被認(rèn)為是引起抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生發(fā)生高甲基化的主要原因之一^［9］。5-Aza-CdR是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)的抑制劑，體外實(shí)驗(yàn)證明其可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長。腎癌中γ-catenin表達(dá)減少可能與其基因甲基化有關(guān)^［3］，國內(nèi)尚無相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)用5-Aza-CdR處理人腎癌細(xì)胞A498后，從MTT法檢測(cè)的細(xì)胞生長曲線可以看出細(xì)胞增殖受到不同程度的抑制。免疫組化顯示，A498細(xì)胞經(jīng)5-Aza-CdR處理后γ-catenin蛋白表達(dá)增加，且與5-Aza-CdR濃度有關(guān)，細(xì)胞生長緩慢，惡性程度下降，說明γ-catenin蛋白具有抑制腎癌細(xì)胞生長的作用。同時(shí)γ-catenin蛋白表達(dá)受甲基化的抑制，5-Aza-CdR可使γ-catenin基因去甲基化恢復(fù)γ-catenin蛋白表達(dá)，這說明腎細(xì)胞癌中γ-catenin基因可能存在過度甲基化，而其過甲基化就是引起γ-catenin蛋白在腎癌細(xì)胞株中表達(dá)下降甚至缺失的主要機(jī)制，這需要更深入的研究。目前，5-Aza-CdR在國外已有用于治療白血病的嘗試^［10］。

γ-catenin蛋白在腎癌細(xì)胞株中表達(dá)明顯下降，5-Aza-CdR能恢復(fù)其表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)γ-catenin基因甲基化的研究為腎細(xì)胞癌治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2011-11-08）

（本文編輯：車艷）