AKT基因被RNA干擾抑制后對卵巢癌SKOV3細胞增殖及凋亡的影響

【摘要】 目的 通過RNA干擾技術阻斷卵巢癌SKOV3細胞中AKT基因的表達，研究其對卵巢癌細胞增殖與凋亡的影響。方法 人卵巢癌SKOV3細胞體外培養，分為對照組、空白載體組與RNA干擾組三組，采用MTT法與流式細胞儀AnnexinV/PI法檢測并評價AKT基因干擾后對卵巢癌細胞增殖、凋亡的影響。結果 MTT結果顯示RNA干擾組細胞增殖能力較對照組與空白載體組明顯降低，差異具有統計學意義（P<0.05），空白載體組與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；流式細胞儀AnnexinV／PI法檢測結果顯示，RNA干擾組細胞凋亡率高達到（79.52±2.31）%，較對照組與空白載體組明顯升高，約是空白載體組與對照組的3倍，差別具有統計學意義（P<0.05）。結論 靶向AKT基因的小干擾RNA（siRNA）可有效地抑制卵巢癌細胞的增殖，促進細胞凋亡，是卵巢癌的治療新方法。

【關鍵詞】 AKT基因； 卵巢癌； siRNA； 增殖； 凋亡

The effect of RNA interference inhibited gene AKT on proliferation and apoptosis of ovarian cancer SKOV3 cells LIU Xiao-wen*，HU Ming-ying.*Weifang Medical University.Weifang 261000，China

【Abstract】 Objective To inhibit the key gene AKT of SKOV3 cells by RNA interference and study the effect of RNA interference on ovarian cancer cell proliferation and apoptosis.Methods Human ovarian carcinoma SKOV3 cells in vitro were divided into the control group，the empty vector group and the RNA interference group.The ovarian cancer cell proliferation，apoptosis was evaluated by MTT method and flow cytometry AnnexinV/PI assay in each group.Results MTT results showed that the cell proliferation in the RNA interference group was significantly lower as compared with the control group and the empty vector group (P <0.05).But there was no significant difference in the cell proliferation between the empty vector group and the control group (P>0.05).The flow cytometry AnnexinV/PI assay showed that the apoptosis rate of RNA interference group ((79.52 ± 2.31)%) was significantly higher than that of the empty vector (P<0.05) and was about 3 times of the empty vector group and the control group.Conclusion AKT-gene-targeted siRNA could inhibite cell proliferation and promoted the apoptosis of ovarian cancer cells，which was a new effective treatment method for ovarian cancer.

【Key words】 AKT gene； siRNA； Proliferation； Apoptosis

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卵巢癌是發生于卵巢組織的惡性腫瘤，其發病率呈逐年上升趨勢。但其發病機制尚不清楚，原癌基因的過度表達和抑癌基因的突變被認為是其主要發病機制之一。因而，在基因水平研究卵巢癌的治療成為近年來的熱點。RNA干擾技術能有效地抑制特定基因的表達，它的效果在多種腫瘤細胞系的實驗中已被證實。近年來有研究表明，PI3K/AKT信號通路與卵巢癌有密切的關系^［1］。為證實這一研究，本實驗以PI3K/AKT信號通路的下游基因AKT為靶點，通過RNA干擾技術抑制其表達，以探討其對人卵巢癌細胞增殖、凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 材料 人卵巢癌SKOV3細胞株以及Mc-coy5A培養基（中國科學院上海細胞生物研究所），Lipofectamine2000（Invitrogen公司），細胞總RNA提取和RT-PCR試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司），四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司），AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司），靶向AKT基因的siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司設計與合成：（AKT-homo-413）正義鏈CCUGGGUAAAGAAGUCAATT，反義鏈UUGACUUCUUUGACCCAGGTT。

1.2 主要儀器 超凈工作臺，CO2培養箱，酶標儀，流式細胞儀等均有濰坊醫學院實驗中心提供。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與轉染 人卵巢癌SKOV3細胞株用10%胎牛血清的Mc-coy5A培養基常規培養并傳代。將細胞分為三組：對照組、空白載體組與RNA干擾組。RNA干擾組：轉染實驗操作步驟按照Lipofectamine 2000TM產品說明書，轉染前1天將5×104個細胞/孔接種于24孔培養板，細胞融合為90%～95%時進行轉染，用無血清無抗生素的培養基稀釋siRNA和Lipofectamine 2000，轉染后6 h更換培養基，48 h后進行轉染后的檢測。空白載體組只添加Lipofectamine 2000，其余操作步驟同RNA干擾組。

1.3.2 細胞增殖的檢測 將細胞制成細胞懸液，按4×103個細胞/孔將三組卵巢癌細胞接種于96孔板中，每組細胞設5個孔及1個空白對照組，每孔加培養基100 μl和MTT液10 μl。置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱內繼續孵育4 h，棄去孔內液體加入DMSO 100 μl后混勻并于接種后24 h、48 h、72 h時進行細胞增殖檢測。酶標儀570 nm處測定各孔的吸光度（A值），A值越大，則表示細胞生長速度越快。

1.3.3 細胞凋亡率的檢測 取對數生長期的三組細胞用0.25%的胰酶消化后，2000轉離心5 min，調整細胞濃度為1×106/ml，以500 μl的結合緩沖液重懸，加入5 μl的Annexin V-FITC混勻，再加入5μl PI，混勻后避光，室溫反應15 min，同時設陰性對照（不加Annexin V-FITC和PI），行流式細胞儀（美國BD公司產品）檢測細胞凋亡率。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，三組間比較采用t檢驗，結果均以均數±標準差（x±s）表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖的檢測結果 應用MTT法檢測三組細胞增殖的結果：RNA干擾組的增殖能力測定值顯著低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），RNA干擾組的細胞增殖率要低于對照組，空白載體組與對照組無明顯差異，見表1。

2.2 細胞凋亡率的檢測結果 流式細胞儀法對三組細胞進行檢測，自動分析細胞凋亡率。結果顯示，RNA干擾組細胞凋亡率顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），空白載體組與對照組無明顯差異，見表2。

3 討論

PI3K/AKT信號通路參與很多重要的生物學過程的調控，但其過度激活可導致腫瘤的發生，在正常的組織中PI3K/AKT信號轉導途徑處于活化狀態，但是該通路如果被過度激活，則可刺激蛋白質合成，抑制細胞凋亡等導致腫瘤的無限增殖，成為腫瘤預后不良的標志^［2］。近年來，PI3K/AKT信號通路備受關注，它已被認為是腫瘤抗凋亡的主要機制之一。目前，以該通路為靶點的腫瘤治療策略正在發展中，阻斷PI3K／AKT通路也成為目前多種腫瘤治療的熱點之一^［3］。相關研究指出，PI3K在約80%的早期卵巢癌細胞和一些上皮性卵巢癌中的表達均有所增高^［4］。如果能有效地阻斷PI3K/AKT信號通路，將為卵巢癌的治療提供一個新的方向。

RNA干擾（RNAi）是指由雙鏈RNA引發的轉錄后基因沉默機制，它通過具有序列特異性的雙鏈RNA（dsRNA）或短發夾狀RNA（shRNA）與靶基因mRNA結合而導致目的基因表達下調^［5，6］。RNAi技術作為一種簡單、有效的工具，對目的基因有很強的抑制作用，在癌基因組功能研究和腫瘤的基因治療中已顯示出優勢^［7］。siRNA表達載體因具有簡便、快速、成本低、轉染效率高、便于穩定篩選等優點，極大促進了RNA干擾技術的應用^［8］。RNA干擾技術可以選擇性地沉默目的基因，抑制目的基因的表達，從而達到抑制腫瘤的增殖生長，對腫瘤起到一定的治療作用。利用這種技術干擾卵巢癌中的相關基因對卵巢癌的治療有著積極的作用。

本研究則通過阻斷PI3K/AKT信號通路的下游通路AKT的表達，從RNA干擾的水平分析研究AKT被沉默后對卵巢癌細胞增殖、凋亡的影響。結果顯示，AKT沉默后細胞的增殖能力明顯減低，凋亡率顯著增加，這一結果為卵巢癌的基因治療以及RNA干擾技術提供了有力的證據，為卵巢癌的治療提供了一個新的方向。卵巢癌的基因治療以及RNAi技術用于腫瘤基因治療必將能夠成為一種常規的、有效的治療手段。

參 考 文 獻

［1］ 郭瑞霞，魏麗惠.磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號傳導通路與婦科惡性腫瘤關系的研究進展［J］.中華婦產科雜志，2005，40(5)：358-360.

［2］ Murakami D，Tsujitani S，Osaki T，et al.Expression of phosphorylated Akt (pAkt) in gastric carcinoma predicts prognosis and efficacy of chemotherapy［J］.Gastric Cancer，2007，10(1):45-51.

［3］ 曾慧敏，王丹紅，劉文賢.PI3K/Akt通路與腫瘤治療［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2008，15(1)：82-85.

［4］ Singh B，Reddy PG，Goberdhan A，et al.P53 regulates cell sunial by inhibiting PIK3CA in squamous cell carcinomas［J］.Genes Dev，2002，16(8):984-993.

［5］ K im VN.Small RNA s classification，biogenesis and function［J］.Mol Cells，2005，9(1):1-15.

［6］ Tomari Y，Zamore PD.Perspective machines for RNAi［J］.Genes Dev，2005，19(5):517-529.

［7］ 祝穎，王旭.RNAi技術應用于婦科腫瘤治療的研究進展［J］.臨床醫學工程，2009，16(5)：100-102.

［8］ Paddison PJ，Candy AA，Bemstein E，et al.Short hairp inRNA s (shRNAs) induce sequence specific silencing in m amm alian cells［J］.Genes Dev，2002，16:948-958.

（收稿日期：2011-11-09）

（本文編輯：連勝利）