三氧化二砷對(duì)乳腺癌細(xì)胞株的抑制作用及其機(jī)制探討

作者單位：056105 河北省冀中能源邯鄲礦業(yè)集團(tuán)總醫(yī)院（趙振江）；邯鄲市中心醫(yī)院（李海新）

通訊作者：趙振江

【摘要】 目的 探討三氧化二砷（arsenous oxide ，As₂O₃）對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制。方法 對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)傳代。As₂O₃作用于細(xì)胞一定時(shí)間后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞凋亡率；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)survivin基因的表達(dá)；電鏡觀察乳腺癌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 As₂O₃對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用是以促進(jìn)細(xì)胞凋亡為主；凋亡抑制因子survivin基因在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)；乳腺癌細(xì)胞經(jīng)As₂O₃作用后，能抑制survivin基因的表達(dá)。結(jié)論 As₂O₃可能通過抑制凋亡抑制因子survivin基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

【關(guān)鍵詞】 三氧化二砷； 細(xì)胞凋亡； 癌基因

本實(shí)驗(yàn)以MCF-7乳腺癌細(xì)胞為靶細(xì)胞，觀察As₂O₃對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥方法 乳腺癌MCF-7細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期時(shí)，以一定濃度接種于培養(yǎng)板中，貼壁后給藥，三氧化二砷組選用0.5 μg/ml、1.0 μg/ml、2.0 μg/ml三種濃度，在給藥48 h后，分別對(duì)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡狀況進(jìn)行檢測(cè)。生理鹽水作為陰性對(duì)照組，1.0 μg/ml DDP作為陽性對(duì)照組。

1.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞凋亡率 收集各As₂O₃組細(xì)胞1×10⁷個(gè)，1000×g離心5 min，細(xì)胞沉淀用PBS洗1次，分散成單細(xì)胞懸液，加入70%冷乙醇4 ℃固定過夜。1000×g離心5 min，棄去上清液，用少量PBS重懸細(xì)胞，加入碘化丙啶PI，終濃度為50 μg/ml，混勻，4 ℃放置1 h，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3 透射電子顯微鏡觀察透射電鏡下腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 收集培養(yǎng)細(xì)胞，用PBS洗2次，2.5%戊二醛4 ℃固定，1%餓酸后固定30 min，梯度酒精脫水，樹脂包埋，超薄切片，鉛鈾染色透射電鏡觀察，拍照。

1.4 RT-PCR檢測(cè)survivin基因的表達(dá) 在MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入As₂O₃（1.5 ml/well），細(xì)胞100%病變后消化收集各組細(xì)胞，采用TRIZOL法提取總RNA，用DNA/RNA測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度。常規(guī)方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min， 94 ℃ 30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)。Survivin引物序列上游：5'-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CT-3'；下游:5'-GAC AGA AAG GAA AGC GCA ACC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為229 bp；β-actin上游:5'-TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA -3';下游:5'-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG -3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為302 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰氨凝膠電泳，溴化乙錠（EB）顯色，Bio-profif凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行攝像分析。通過survivin/β-actin的灰度比值作相對(duì)定量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 12.0軟件處理，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)分析 實(shí)驗(yàn)組的腫瘤細(xì)胞均可見有G1前期細(xì)胞形成的凋亡峰，陰性對(duì)照組對(duì)照組（1A）、0.5 μg/ml組（1B）、1.0 μg/ml組（1C）、2.0 μg/ml組（1D）凋亡率分別為5.4%、21.9%、26.4%、36.9%。見圖1。

2.2 透射電鏡下腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變 三氧化二砷（2 μg/ml）時(shí)透射電鏡下見細(xì)胞質(zhì)濃縮，核碎裂，染色質(zhì)濃縮于核膜（圖2）。

2.3 As₂O₃誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡時(shí)survivin基因表達(dá)的變化 從圖3可知，survivin基因在乳腺癌細(xì)胞中存在高表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示，As₂O₃誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡時(shí)，survivin基因的mRNA受到抑制。對(duì)照組Survivin gene/β-actin為（0.502±0.174），陽性對(duì)照組為（0.407±0.134），1.0 μg/ml As₂O₃組為（0.392±0.105），DDP組和1.0 μg/ml As₂O₃組分別與細(xì)胞對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

人們對(duì)As₂O₃抗腫瘤的機(jī)制進(jìn)行了多方面的探討。有學(xué)者認(rèn)為，As₂O₃抗腫瘤的機(jī)制是抑制bcl-2基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；有學(xué)者認(rèn)為As₂O₃能增加Fas、Fas-L表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。頡東旭等^［1］認(rèn)為，多數(shù)促癌基因經(jīng)As₂O₃誘導(dǎo)后表達(dá)下調(diào)，而多數(shù)腫瘤抑制基因則表達(dá)上調(diào)。

Survivin基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞凋亡抑制因子。Survivin的組織分布特征與其他凋亡抑制因子有著顯著不同，具有明顯的細(xì)胞選擇性，主要表達(dá)于胚胎和發(fā)育的胎兒組織，但不見于終末分化的成人組織（胸腺和生殖腺除外），而多數(shù)癌組織中高表達(dá)。用As₂O₃作用乳腺癌MCF-7細(xì)胞，檢測(cè)survivin基因表達(dá)同時(shí)結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)法觀察As₂O₃促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用，結(jié)果表明，As₂O₃作用乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示有大量的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡，同時(shí)RT-PCR結(jié)果顯示，survivin基因表達(dá)明顯受到抑制，說明survivin基因在As₂O₃誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，As₂O₃對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用，與survivin基因表達(dá)受抑制有關(guān)。

用1.0 μg/ml As₂O₃作用于乳腺癌細(xì)胞，動(dòng)態(tài)觀察As₂O₃的抗腫瘤效果，發(fā)現(xiàn)As₂O₃抑制乳腺癌細(xì)胞，具有時(shí)間依賴性。通過用順鉑（DDP）作為陽性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)As₂O₃抗腫瘤效果與DDP相似，但As₂O₃的臨床不良反應(yīng)小。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，As₂O₃可以替代DDP，并具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ 頡東旭，丁芬，王秀琴，等.As₂O₃誘導(dǎo)人食管鱗狀上皮癌EC8712細(xì)胞基因表達(dá)概況分析.科學(xué)通報(bào)，1999，44（12）:1287-1292.

（收稿日期：2011-03-18）

（本文編輯：車艷）