干擾素在肝癌治療中耐藥性問題的研究

作者單位：262500 山東省青州市高柳中心衛(wèi)生院

通訊作者：徐蕊

【摘要】 目的 探討干擾素受體表達(dá)水平與臨床疾病二者之間進(jìn)展的關(guān)系，從而更進(jìn)一步研究干擾素應(yīng)答的相關(guān)機(jī)制和因素。方法 采用流式細(xì)胞技術(shù)和細(xì)胞免疫組化對(duì)三組患者的外周血淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞膜進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 通過檢測(cè)干擾素受體水平發(fā)現(xiàn)，肝癌組和對(duì)照組干擾素受體水平存在明顯的差別，即肝癌組患者的受體水平低于對(duì)照組。結(jié)論 產(chǎn)生干擾素耐藥的肝癌患者組的干擾素受體（IFANR2）水平明顯降低。

【關(guān)鍵詞】 干擾素耐藥； 肝癌； 流式細(xì)胞術(shù)； 免疫組化

干擾素（IFN）的分泌是病毒感染后機(jī)體最先啟動(dòng)的防御機(jī)制，在細(xì)胞培養(yǎng)體系及動(dòng)物模型中，IFN可以抑制多種DNA及RNA病毒的復(fù)制^［1］。研究發(fā)現(xiàn)，盡管IFN是目前公認(rèn)的治療肝癌較為有效的藥物，但干擾素耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。學(xué)者們正在努力尋找影響干擾素應(yīng)答率的預(yù)測(cè)指標(biāo)，以提高療效。本試驗(yàn)筆者利用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫組化方法檢測(cè)外周血相應(yīng)細(xì)胞表面干擾素受體的表達(dá)，從而更進(jìn)一步來探究干擾素的耐藥現(xiàn)象，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 外周血單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞采自15名肝癌患者，其中男8例，女7例，平均年齡（35.3±4.6）歲。其中8名肝癌患者（肝癌組）是經(jīng)過長(zhǎng)期干擾素治療同時(shí)又未給予手術(shù)治療的對(duì)干擾素反應(yīng)性下降的患者，余7名肝癌患者（陽性對(duì)照組）為未經(jīng)手術(shù)治療但對(duì)干擾素有一定反應(yīng)性的患者。5例門診健康體檢者為對(duì)照組。所有患者均進(jìn)行血常規(guī)、血生化、B超、血清肝癌特異性抗原檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化 外周血細(xì)胞的分離用常規(guī)的方法分離外周三種細(xì)胞，馬上滴在載玻片上，待玻片上細(xì)胞干后，立即用丙酮進(jìn)行固定，30 min后放入-70 ℃冰箱，統(tǒng)一進(jìn)行免疫組化。實(shí)驗(yàn)步驟：（1）采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法操作。載玻片放入室溫下10 min溶化，用過氧化物酶封閉試劑封閉內(nèi)源性過氧化物酶5 min；（2）在枸櫞酸那鹽緩沖液中進(jìn)行微波爐抗原熱修復(fù)3 min；（3）磷酸鹽緩沖液（PBS）連續(xù)洗2次，每次5 min；（4）將切片標(biāo)本置于濕盒內(nèi)加10%正常兔血清，室溫下放置15 min；（5）棄去多余血清，加入抗生物素蛋白封閉試劑，室溫下放置15 min；（6）PBS洗后小心的擦掉多余PBS加入生物素蛋白封閉試劑室溫下孵育15 min；（7）PBS漂洗后滴加一抗1∶1000（兔抗人alpha/betachainZ 受體多克隆抗體，為美國(guó)服RD公司產(chǎn)品），放入4 ℃冰箱過夜；（8）PBS連續(xù)洗2次，每次5 min，滴加二抗（生物素標(biāo)記羊抗兔，美國(guó)RD公司產(chǎn)品），37 ℃孵育55 min；（9）PBS連續(xù)洗2次，每次4 min，滴加酶標(biāo)底物（辣根酶標(biāo)記鏈霉菌親和素，美國(guó)RD公司產(chǎn)品），37 ℃ CO₂孵育30 min；（10）PBS連續(xù)洗2次，每次2 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗。

1.2.2 流式細(xì)胞技術(shù) 對(duì)慢性肝病患者的干擾素受體進(jìn)行分析和指標(biāo)檢測(cè)。采集靜脈血1 ml置于EDTA-K2抗凝管內(nèi)，在5 h內(nèi)進(jìn)行干擾素受體（IFNRA2）表達(dá)檢測(cè)。取肝素鈉抗凝外周血100 μl 2份，分別加入熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG1-FITC（control）和IFN-α/βRα（H-11）（實(shí)驗(yàn)管）20 μl；將10×溶血素稀釋成1×，加入1×溶血素1 ml，使紅細(xì)胞溶解；加入PBS 1.5 ml；實(shí)驗(yàn)管加入羊抗小鼠IgG1－FITC 20 μl，室溫避光孵育20 min;實(shí)驗(yàn)管加入PBS 2.5 ml；加入1%多聚甲醛1 ml。標(biāo)本置流式細(xì)胞儀（FACSCalibur型 美國(guó)Becton Dickinson公司產(chǎn)品）檢測(cè)。選定單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，每次每樣標(biāo)本細(xì)胞數(shù)均大于10 000個(gè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SASS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件整理并分析所得數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。采用方差分析和秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化 用低倍和高倍鏡依次觀察切片，陽性細(xì)胞為鏡下組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)輪廓清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒沉著，染色明顯高于背景。經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)干擾素受體水平，見表1。

表1 健康者與肝癌患者三種外周血細(xì)胞干擾素

受體水平 （%）

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)臨床肝癌患者外周單核細(xì)胞膜干擾素受體的表達(dá)率，見表2。通過檢測(cè)干擾素受體的水平發(fā)現(xiàn)，肝癌組和對(duì)照組干擾素受體水平存在明顯的差別，即肝癌組患者的受體水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表2 肝癌患者外周單核細(xì)胞膜干擾素受體的表達(dá)率（%）

3 討論

人的干擾素受體（hINFR）分為兩型，α、β共用Ⅰ型受體（IFNa/bR），IFNgamma為Ⅱ型受體，其中IFNa/bR有兩個(gè)已知的亞單位^［2］。IFNAR2短鏈及可溶形式缺少胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)部分，卻可與干擾素結(jié)合，故其主要表現(xiàn)為抑制作用^［3］。隨著干擾素作用機(jī)制的闡明，干擾素已成為目前慢性病毒性肝炎治療的主要藥物，但其嚴(yán)重的不良反應(yīng)及較低的持續(xù)應(yīng)答率限制了其進(jìn)一步的廣泛應(yīng)用。檢測(cè)干擾素受體表達(dá)水平可作為評(píng)價(jià)肝臟嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一^［4］。而維持機(jī)體正常的干擾素受體表達(dá)功能，干擾素的敏感性對(duì)肝癌的治療具有非常重要的意義。

通過本次實(shí)驗(yàn)，筆者對(duì)IFNAR2的研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者外周血細(xì)胞（單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞）干擾素受體水平低于健康對(duì)照者的受體水平，因此筆者認(rèn)為肝癌患者對(duì)干擾素的應(yīng)答率下降的一個(gè)很重要的原因很可能是其細(xì)胞表面干擾素受體下降所導(dǎo)致的。但由于干擾素受體種類較多，具體細(xì)化到是哪種受體的下降起了最主要的作用，還需進(jìn)一步的臨床研究。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ Zhu H，Nelson DR，Crawford JM，et al.Defective JAK-STAT activation in hepatoma cells is associated with hepatitis C viral IFN-alpha resistance. Interferon Cytokine Res，2005，25（9）:528-539.

［2］ McDermott DF， Atkins MB. Immunotherapy of metastatic renal。 cell carcinoma， 2008，14（5）:320-324.

［3］ Christine Prejean. Role of the cytoplasmic domains of the type I interferonreceptor subunits in signaling. Gancer Biology， 2000，10（1）:83-92.

［4］ Yamaguchi Y， Hino K， Fujiwara D，et al. Expression of type I interferon receptor in liver and peripheral blood mononuclear cells in chronic hepatitis C patients. Digestive Diseases and Sciences，2002，47（2）:1611-1617.

（收稿日期：2011-03-11）

（本文編輯;車艷）