miR-24對胃癌細胞株BGC-803及SGC-7901凋亡和增殖的影響

基金項目：973項目（2005CB724602）和中科院重要方向性項目（KSCX-2-SW-228和KSCX1-YW-R-64）

作者單位：200050 上海市長寧區同仁醫院（金立）；中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所分子生物學國家重點實驗室（秦文明，金由辛）

通訊作者：秦文明

【摘要】 目的 探討在兩株胃癌細胞株BGC-823及SGC-7901中抑制內源性miR-24的表達后對細胞凋亡和增殖的作用。方法 使用INTERFERin轉染試劑將鎖核苷酸標記的反義核酸miR-24-ASO轉染進入胃癌細胞株，使用倒置熒光顯微鏡觀察細胞生長變化，流式細胞計檢測細胞凋亡的比例，然后使用CCK-8試劑盒對細胞增殖情況進行檢測。結果 轉染miR-24-ASO的BGC-803細胞和SGC-7901細胞相對于轉染內參的凋亡水平分別增加了約2.5倍和2.1倍左右。轉染了miR-24-ASO抑制內源性miR-24的表達之后細胞的增殖能力相對于轉染陰性對照的細胞株的增殖能力均明顯降低。結論 抑制內源性miR-24的表達可以誘導胃癌細胞的凋亡并導致胃癌細胞增殖能力的降低。miR-24調控了胃癌細胞的增殖和凋亡過程。揭示了miRNA在胃癌發生過程中的調控機制，并為胃癌的治療提供了良好的應用前景。

【關鍵詞】 miR-24； miR-24-ASO； 胃癌； 凋亡； 治療應用

The influence of miR-24 togastic cancercell line BGC-803 and SGC-7901 apoptosis and proliferation ^*JIN Li，QIN Wen-ming，JIN You-xin.^*Tongren Hospital of changning District，Shanghai 200050，China

【Abstract】 Objective To Explove the two cancer line BGC-803 and SGC-7901 in the inhibition of endogenous miR-24 after the expression of apoptosis and proliferation.Methods miR-24-ASO was transfected into BGC-803 and SGC-7901 cells with transfection agent to down-regulate the expression of endogenous miR-24. The cellular growth activity was assayed by CCK-8 kit， and the apoptosis was tested by flow cytometry.Results The apoptosis rates of BGC-803 and SGC-7901 cells transfected with miR-24-ASO were about 2.5 and 2.1 times more than which transfected with negative control NC-ASO. The ability of proliferation of BGC-803 and SGC-7901 cells was greatly reduced after miR-24 was down-regulated by miR-24-ASO.Conclusion The miR-24 down-regulation can suppress the cellular proliferation and induce apoptosis in BGC-803 and SGC-7901 cells. miR-24 regulates cell proliferation and apoptosis in gastric cancer cells. And it may have a strong rationale for therapeutic applications in gastric cancer in the future.

【Key words】 MiR-24； MiR-24-ASO； Gastric cancer； Apoptosis； Therapeutic applications

microRNA（miRNA）是不能編碼蛋白質的一類內源性小分子RNA。它們通過與編碼蛋白質基因的mRNA互補結合進行轉錄后的調控^［1］。miRNA在動植物中通過降解靶基因mRNA或者抑制靶基因mRNA的蛋白翻譯行使著許多重要的功能。目前的研究已經發現miRNA在發育、細胞分化、胚胎生成、細胞周期調控以及細胞凋亡等許多生命活動中發揮著重要的作用。另外，miRNA還與心腦血管、神經系統疾病以及癌癥等許多疾病的發生有著密切的關系^［2～4］。

許多研究已經發現miRNA在多種癌組織中相對于正常組織有著異常的表達水平，這些miRNA影響著腫瘤的增殖和凋亡，它們可能起到了原癌基因或抑癌基因的作用^［5］。胃癌是人類常見的一種惡性腫瘤，在胃癌中也已經發現了許多異常表達的miRNA，其中miR-24在胃癌組織中的表達水平明顯升高。提示miR-24在胃癌的發生發展過程中起到重要的作用^［6～8］。本文通過轉染鎖核酸標記的miR-24反義核酸miR-24-ASO降低內源性miR-24在兩株胃癌細胞株SGC-7901和BGC-803細胞中的表達水平。結果發現在這兩株胃癌細胞株中抑制內源性miR-24的表達可以誘導這兩株細胞發生凋亡。進一步對抑制內源性miR-24之后胃癌細胞株的增殖情況進行檢測，結果發現使用反義核酸miR-24-ASO抑制內源性的miR-24表達之后的胃癌細胞株的增殖能力均明顯降低。這些結果表明miR-24調控了胃癌細胞的增殖和凋亡。使用miR-24反義核酸抑制內源性的miR-24表達對胃癌的治療有著重要的應用前景。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 SGC-7901、BGC-803細胞均購自中科院上海生科院細胞庫。細胞在添加了10%胎牛血清（Sigma），100 μg/μL青霉素-鏈霉素雙抗（Sigma）的RPMI-1640培養基（水生生物）中37 ℃下5%二氧化碳環境中傳代培養。轉染所用細胞培養基中不加入青霉素-鏈霉素雙抗。

1.2 細胞轉染 細胞在大約70%密度下使用INTERFERin （Polyplus）轉染試劑進行轉染。根據商家提供的標準操作步驟對合成的鎖核苷酸標記的miRNA反義核酸（miR-24-ASO）及陰性對照（NC-ASO）進行轉染。轉染后不同的時間點收集細胞并進行下一步的分析。使用的反義核酸序列如下：LNA NC-ASO，5' caCTTATCagtcAGACCAtcGT 3'；LNA 24-ASO，5' ctGTTCCTgctgAACTGAgcCA 3'（小寫字母表示鎖核酸標記位點）。

1.3 細胞增殖分析 使用CCK-8試劑盒（Dojindo）對轉染后的細胞增殖情況進行分析。細胞在24孔板中按每孔約5×10⁴個細胞進行鋪板，使用生長培養基培養。然后12孔中轉染20 nM的miR-24-ASO，同時另外12孔中轉染20 mM的NC-ASO作為對照。分別在轉染1、2、3、4 d后加入10 μL CCK-8檢測試劑，反應2 h候吸取上清液，在分光光度計下檢測450 nm下的吸收光，每次檢測取三個復孔。使用sigmaplot軟件作出轉染后細胞的增殖曲線。

1.4 細胞凋亡流式細胞分析 使用流式細胞Annexin-V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒（Sigma），對轉染后的胃癌細胞進行凋亡分析。細胞轉染miR-24-ASO或NC-ASO寡核苷酸48 h后收集細胞，使用垂直離心機以4000 r/min轉速離心5 min收集細胞。使用PBS緩沖液洗兩遍后加入300 μL的結合緩沖液重懸細胞，然后加入2 μL的Annexin V-FITC和4 μL的PI染料進行染色。染色10 min后進行流失細胞儀進行細胞凋亡分析。使用WinMDI軟件分析轉染后細胞凋亡的變化。

2 結果

2.1 抑制miR-24的表達可以誘導胃癌細胞BGC-803、SGC-7901發生凋亡 使用INTERFERin轉染試劑向胃癌細胞株BGC-803和SGC-7901分別轉染20 mM鎖核苷酸標記的miR-24反義核酸miR-24-ASO，以抑制內源性miR-24的表達水平，同時轉染20 mM的NC-ASO作為參照。在轉染48 h之后，分別使用倒置顯微鏡觀察細胞的生長狀況。結果發現，使用miR-24-ASO轉染的細胞相對于轉染陰性內參細胞的凋亡水平在BGC-803和SGC-7901兩個胃癌細胞株中都發生了明顯了增加（圖1）。進一步驗證抑制miR-24的表達對胃癌細胞凋亡情況的影響，筆者收集了培養基中的細胞并用胰酶消化貼壁的細胞，使用PBS緩沖液洗滌后，使用結合緩沖液重懸細胞，然后加入Annexin V-FITC和PI染料進行染色。接下來使用流式細胞儀對轉染后細胞的凋亡水平進行定量分析。結果發現相對于轉染內參的細胞，抑制miR-24表達以后的兩個胃癌細胞株的凋亡水平均出現了明顯的增多（圖2A）。使用Sigmaplot軟件對三次重復的結果進行統計分析，結果發現轉染miR-24-ASO的BGC-803細胞相對于轉染內參的凋亡水平增加了約2.5倍，轉染miR-24-ASO的SGC-7901細胞相對于轉染內參的凋亡水平也增加了約2.1倍左右。計算得到的P值分別為0.000和0.018，均具有統計學意義（圖2B）。

2.2 抑制miR-24的表達可以降低胃癌細胞SGC-7901、BGC-803的增殖能力 使用CCK-8試劑盒對轉染后的細胞增殖情況進行分析。細胞鋪板后使用生長培養基培養。然后分別轉染20 nM的miR-24-ASO和20 mM的NC-ASO。分別在轉染1、2、3、4 d后加入10 μL CCK-8檢測試劑，反應2 h后吸取上清液，在分光光度計下檢測450 nm下的吸收光，每次檢測取三個復孔。使用sigmaplot軟件作出轉染后細胞的增殖曲線。結果顯示在兩個胃癌細胞株BGC-823和SGC-7901中，轉染了miR-24-ASO抑制內源性miR-24的表達之后細胞的增殖能力相對于轉染陰性對照的細胞株的增殖能力均明顯降低（圖3）。

3 討論

miRNA是最近發現的生物體內源表達的一類非編碼蛋白的RNA調控因子。隨著研究的深入，發現越來越多的這類小分子非編碼RNA在生物體內參與了的生物進程。目前已經知道miRNA與細胞周期、增殖、凋亡、分化和發育等多種生物進程相關^［1］。最近的研究也證明，miRNA在許多疾病（如糖尿病、心腦血管疾病和癌癥等）中有著異常的表達，更多的證據進一步證明miRNA參與了這些疾病的發生發展過程^［9～11］。近年來，miRNA在腫瘤發病中的作用受到人們的關注。研究發現，50%以上的miRNA基因定位在與腫瘤相關的區域，及多種腫瘤中均存在miRNA異常表達^［12］。許多實驗也證明了miRNA可以通過靶向重要的細胞生長調控因子作為癌基因或者抑癌基因行使功能^［13］。盡管miRNA在癌癥發生過程中的機制研究還不是非常明了，許多研究已經可以通過已知的miRNA知識對癌癥做出診斷，甚至通過超表達或已知miRNA的表達對癌癥進行治療。這為揭示癌癥的發病機制以及癌癥的治療提供了重要的理論和實踐基礎。

細胞凋亡是多細胞生物體中的細胞程序性死亡的一種形式。細胞凋亡體現為細胞內一系列生化指標的變化、細胞的形態變化以及細胞的死亡。越來越多的證據表明miRNA能夠在發育過程中以及其他一些生物進程中調控細胞的凋亡，同時也發現了一些與凋亡相關的miRNA^{［14，15］}。例如miR-15和miR-16能夠通過靶向抗凋亡因子Bcl-2參與細胞凋亡過程^［16］。miR-29可以通過結合到Mcl-1的3'非翻譯區并抑制其蛋白翻譯而參與細胞凋亡的調控過程^［17］。另外，miRNA還可以通過調控已下抑癌基因或者癌基因參與細胞凋亡的調控。研究發現，miR-21可以通過靶向PDCD4，TPM1及PTEN等蛋白基因參與調控細胞凋亡過程^{［18～20］}。

胃癌預后差，病死率高的一個很重要原因是胃癌細胞自身存在的或在使用化療藥物后獲得的多藥耐藥性。在腫瘤細胞對化療藥物耐藥性的產生過程中，miRNA也發揮了重要的作用。Xia等通過研究發現了一系列miRNA它們在胃癌多藥耐藥細胞系SGC7901/VCR中存在著表達差異。而且，在表達下調的miRNA中，miR215和miR216通過調控其靶基因-凋亡抑制基因Bcl-2，在胃癌細胞多藥耐藥性的發展中發揮重要作用^［21］。目前，圍繞胃癌的miRNA研究已經展開，并不斷深入。幾個基于芯片技術和生物信息學方法的研究，已發現了一些與胃癌關系密切的miRNA。其中miR-21和miR-24在胃癌組織中都有著明顯的異常表達升高^［7］。表明這兩個miRNA與胃癌的發生有著重要的關系。研究也已經證明了miR-21在胃癌細胞的增殖和遷移等生物過程中起著重要的作用。許多研究發現miR-24參與了許多細胞的增殖和凋亡過程^［22］。miR-24可以通過靶向抑癌基因p16（INK4a）的蛋白翻譯對細胞增殖進行調控^［23］。同時miR-24還在視網膜神經發育過程中起到了抑制細胞凋亡的作用^［24］。這些研究都表明miR-24可能參與了胃癌細胞的增殖和凋亡。

在本文中，筆者通過轉染鎖核苷酸標記的miR-24的翻譯核酸miR-24-ASO抑制胃癌細胞株BGC-823和SGC-7901中的內源性miR-24的表達，發現胃癌細胞株在內源性miR-24表達水平下調后出現了明顯的凋亡。同時抑制內源性miR-24的表達后這兩株胃癌細胞的增殖能力也明顯減弱。證明了miR-24調控了胃癌細胞的增殖和凋亡過程。揭示了miRNA在胃癌發生過程中的調控機制，并為胃癌的治療提供良好的應用前景。

參 考 文 獻

［1］ Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell，2009，136:215-233.

［2］ Cordes KR， Srivastava D， Ivey KN.MicroRNAs in Cardiac Development. Pediatr Cardiol，2010，31（3）：349-356.

［3］ Foshay KM，Gallicano GI. Small RNAs， big potential: the role of MicroRNAs in stem cell function. Curr Stem Cell Res Ther，2007，2（4）:264-271.

［4］ Nimmo RA， Slack FJ. An elegant miRror: microRNAs in stem cells， developmental timing and cancer. Chromosoma，2009，118:405-418.

［5］ Casalini P， Iorio MV. MicroRNAs and future therapeutic applications in cancer. J BUON，2009，14 （1）:17-22.

［6］ Bhatti I， Lee A， Lund J，et al.Small RNA: a large contributor to carcinogenesis. J Gastrointest Surg，2009，13:1379-1388.

［7］ Volinia S， Calin GA， Liu CG， et al. A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc Natl Acad Sci，2006，103:2257-2261.

［8］ Ueda T， Volinia S， Okumura H， et al. Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric cancer: a microRNA expression analysis. Lancet，2010，11:136-146.

［9］ Bandiera S， Hatem E， Lyonnet S，et al.A microRNAs in diseases: from candidate to modifier genes. Clin Genet，2010，77（4）：306-313.

［10］ Catalucci D， Gallo P， Condorelli G. MicroRNAs in cardiovascular biology and heart disease. Circ Cardiovasc Genet，2009，2:402-408.

［11］ Chua JH， Armugam A， Jeyaseelan K. MicroRNAs: biogenesis， function and applications. Curr Opin Mol Ther，2009，11:189-199.

［12］ Calin GA， Sevignani C， Dumitru CD， et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc Natl Acad Sci，2004， 101:2999-3004.

［13］ Shenouda SK， Alahari SK. MicroRNA function in cancer: oncogene or a tumor suppressor.Cancer Metastasis Rev，2009， 28:369-378.

［14］ Lynam-Lennon N， Maher SG， Reynolds JV. The roles of microRNA in cancer and apoptosis. Biol Rev Camb Philos Soc，2009，84:55-71.

［15］ Wang Y， Lee CG.MicroRNA and cancer-focus on apoptosis. J Cell Mol Med，2009，13:12-23.

［16］ Cimmino A， Calin GA， Fabbri M， et al. miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2. Proc Natl Acad Sci，2005，102:13944-13949.

［17］ Mott JL， Kobayashi S， Bronk SF， et al. mir-29 regulates Mcl-1 protein expression and apoptosis. Oncogene，2007，26:6133-6140.

［18］ Frankel LB， Christoffersen NR， Jacobsen A， et al. Programmed cell death 4 （PDCD4） is an important functional target of the microRNA miR-21 in breast cancer cells. J Biol Chem，2008， 283:1026-1033.

［19］ Krichevsky AM， Gabriely G. miR-21:a small multi-faceted RNA. J Cell Mol Med，2009 13:39-53.

［20］ Pezzolesi MG， Platzer P， Waite KA， Eng C.Differential expression of PTEN-targeting microRNAs miR-19a and miR-21 in Cowden syndrome. Am J Hum Genet，2008，82:1141-1149.

［21］ Xia L， Zhang D， Du R， et al. miR-15b and miR-16 modulate multidrug resistance by targeting BCL2 in human gastric cancer cells. Int J Cancer，2008，123:372-379.

［22］ Lin SC， Liu CJ， Lin JA， et al. miR-24 up-regulation in oral carcinoma:Positive association from clinical and in vitro analysis. Oral Oncol，2010，46:204-208.

［23］ Lal A， Kim HH， Abdelmohsen K， et al. p16（INK4a） translation suppressed by miR-24. PLoS One，2008，3:e1864.

［24］ Walker JC， Harland RM. microRNA-24a is required to repress apoptosis in the developing neural retina. Genes Dev，2009，23:1046-1051.

（收稿日期：2011-03-17）

（本文編輯：王春蕓）