原癌基因pokemon的mRNA在腎癌中的表達及其意義

[摘要]目的 檢測腎癌組織中pokemon的mRNA的表達，分析其與各臨床病理特征間的關系。方法 收集47例腎細胞癌手術切除的癌、癌旁及臨近正常組織，應用逆轉錄實時聚合酶鏈反應（Real-time PCR）檢測標本中pokemon基因的表達，并對其與腎癌的臨床病理特征進行分析。結果 Real-time PCR檢測腎細胞癌、癌旁及正常對照組織中pokemon的mRNA表達有差異，具有統計學意義（P＜0.01）。腎細胞癌組織中pokemon的mRNA表達與腫瘤病理分級有關，而與患者的性別、年齡、腫瘤最大直徑、TNM臨床分期及病理學類型無明顯相關性。結論 pokemon的mRNA表達和腎細胞癌的發病及惡性程度有關，可能成為腎癌治療的有效靶點。

[關鍵詞] Pokemon；腎細胞癌；實時聚合酶鏈反應

[中圖分類號]R737.11 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）27-17-03

Expression of Pokemon mRNA and Its Clinical Significance in Renal Cell Carcinoma

HOU Liejun1ZHENG Junhua2GENG Jiang2 GU Wenyu2WANG Bo2

1.Department of Urinary Surgery， Affiliated Hospital of Ningbo University， Ningbo 315020， China; 2.Department of Urinary Surgery， Shanghai No.10 People’s Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200072，China

[Abstract] Objective To explore the expression of pokemon in human renal cell carcinoma and its correlation with clinical features. Methods Reverse transcription Real-time PCR applied to detect the expression of pokemon in 47 cases of resection samples， their corresponding paracancerous samples and normal samples. Correlation between expression of pokemon and clinical-pathological features was analyzed. ResultsThe expression of pokemon mRNA was significantly higher in the cancerous tissues than those in the paracancerous tissues and normal tissues（P＜0.01）. The expression of pokemon was related to tumor differentiation degree， but has no correlation with patient’s gender， age， maximum diameter of tumor，pathological type and TNM stages. ConclusionPokemon is expressed in human renal cell carcinoma and it may play a key role in the genesis of renal cell cancer. It may be the therapeutic target of renal cell carcinoma in the future.

[Key words] Pokemon；Renal cell carcinoma；Real-time PCR

近年發現的原癌基因Pokemon被認為是抑制多種抑癌基因從而使致癌基因發揮作用的上游關鍵基因，在致癌轉化中起了核心作用，已有研究發現Pokemon在某些人類惡性腫瘤中存在過表達。本實驗應用Real-time PCR檢測Pokemon的mRNA在腎癌中的表達，從而探討Pokemon與腎癌發病機制及臨床病理特征的相關性。

1#8195;材料與方法

1.1#8195;標本來源

本實驗標本取自上海市第十人民醫院泌尿外科2010年2月~2011年2月腎腫瘤手術，且經術后HE染色病理診斷明確為腎細胞癌。經靶向治療后行姑息性減瘤術以及伴發其他臟器原發惡性腫瘤的患者未納入本研究。標本切取方法為：腫瘤實質內非壞死區作為腫瘤組，緊鄰腫瘤假包膜以外腎組織作為癌旁組，距腫瘤最遠部切下的經HE染色病理證實為非腫瘤侵犯的腎臟組織作為正常對照組。標本切下后即用液氮速凍保存，實驗前轉至-80℃低溫冰箱。入組共47例，其中男 27例，女 20例，年齡30～76歲，中位年齡56歲。腫瘤直徑≤4.1cm的24例，＞4.1cm的23例；T1期40例，T2+T3+T4期7例；有淋巴結轉移43例，未發現淋巴結轉移4例；未發現遠處轉移44例，遠處轉移3例；透明細胞癌33例，乳頭狀腺癌7例，嫌色細胞癌4例，集合管癌3例；低分化癌13例，中分化癌14例，高分化癌20例；臨床分期Ⅰ+Ⅱ期41例，Ⅲ+Ⅳ期6例?；颊咝g前均未進行化學治療、放射治療或細胞因子治療。

1.2#8195;主要試劑與儀器

RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen 公司，逆轉錄試劑盒及Real-Time PCR試劑盒購自Takara公司，2×Taq PCR MasterMix及100bp DNA Ladder購自天根生化科技有限公司，10×SYBR GreenⅠ購自Lonza Rockland公司。核酸分光光度定量儀（95801）購自GE公司，RT及PCR儀（22331）購自德國Eppendorf公司，Real-time PCR儀（7900HT Fast Real-time熒光定量）購自Applied Biosystems公司。

1.3#8195;PCR引物

在Pubmed的Genbank中查閱Pokemon及β-actin的mRNA序列，自行設計并由上海生物工程有限公司合成。Pokemon具體引物序列為：上游5’- GAGTGCAACATCTGCAAGGTC-3’，下游5’- CATGTGGTTCTTCAGGTCGTAG -3’，產物長度141bp；β-actin具體引物序列為：上游5’- TCATCACCATTGGCAATGAG-3’，下游5’- CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3’，產物長度155bp。

1.4#8195;逆轉錄Real-time PCR檢測

取出-80℃冰箱保存組織，勻漿后TRIzol法提取，依次用氯仿、異丙醇、75%乙醇分離純化，溶于無RNase水，用分光光度計測定RNA純度，并經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA有無降解及程度。取TaKaRa公司PrimeScript RT試劑盒，按說明書逆轉錄合成cDNA，根據TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq說明書進一步行Real-time PCR反應，具體反應體系為：2×SYBR Premix Ex Taq 5μL，Dye ROX（50×）0.2μL，cDNA 1μL，Primer (10μM)各0.2μL，dH2O 3.4μL。在Real-time PCR儀（7900HT Fast Real-time熒光定量）上設置循環參數：95°C 30s預變性，然后40個循環的PCR反應（95°C 5s，60°C 30s），最后熔解曲線分析，判斷擴增特異性。以β-actin作為內參照，每個樣品同時做兩個復孔，獲取Ct值后參考Livak， K等[1]的方法計算2－ΔΔCt值，進行統計學分析。

1.5#8195;統計學處理

所得數據用SPSS11.0軟件數據包進行統計分析，癌、癌旁和正常組織所得計量資料用隨機區組方差分析統計，與各臨床病理特征間的關系用t檢驗或單因素方差分析進行統計，兩兩間比較采用LSD法，計量資料以（χ±s）的形式表示。檢驗水準α=0.05。

2#8195;結果

2.1#8195;Pokemon的mRNA在腎癌、癌旁及正常組織中的表達差異

7900HT Fast Real-time熒光定量儀顯示PCR擴增良好，溶解曲線證明擴增特異性（圖1~4）。熒光定量Real-time PCR所得Ct值經2－ΔΔCt方法計算處理，隨機區組方差分析提示Pokemon的mRNA在腎癌、癌旁和正常組織中表達有差異，具有統計學意義（P＜0.01）。進一步行組間比較提示mRNA在腎癌組的表達與癌旁及正常組比較差異均有統計學意義（P＜0.01），明顯高于癌旁和正常組，癌旁和正常組差異無統計學意義（P＞0.05）

2.2Pokemon的mRNA與腎癌各臨床病理特征間的關系

Pokemon的mRNA表達與腎癌患者的病理分級有關，而與性別、年齡、腫瘤最大直徑、T、N、M、臨床分期及病理類型無明顯相關性。見表1。

3#8195;討論

近年發現的原癌基因Pokemon（又叫ZBTB7A、LRF、FBI-1），定位于人類第19號染色體短臂1區3帶中的第3亞帶（19p13.3），具有2個外顯子和2個內含子，其編碼產物是一種轉錄抑制因子，屬于POK家族。Pokemon最初是做為HIV-1啟動子的特異性結合蛋白被發現的[2]，其特殊的鋅指結構能介導特異性DNA序列的識別和結合；而POZ域的主要功能是在Pokemon結構完整的前提下和BCL-6等的POZ域形成同源或異源二聚體，POZ域相互作用易于輔阻遏物結合成復合體，激活Pokemon與目標基因靶點結合，從而抑制目標基因的轉錄[3]。

Pokemon作為一種轉錄抑制因子可影響多種腫瘤相關因子的轉錄，從而影響腫瘤的發生發展。研究發現Pokemon強效抑制在細胞周期阻滯中起重要作用的腫瘤抑制因子Rb基因的轉錄[4]。Maeda等[5]發現鼠Pokemon使致癌轉化中腫瘤抑制蛋白ARF水平下降，ARF表達的抑制導致了Mdm2介導的p53的穩定性或活性降低，從而刺激細胞的增殖。此即為Pokemon-ARF-Mdm2-p53通路。而Won-Il Choi等[6]的最新研究認為，Pokemon不僅抑制p53，還抑制ARF、Hdm2（人類中與鼠Mdm2同源蛋白）和細胞周期阻滯因子p21CIP1（以下簡稱為p21）的轉錄。Pokemon對p21基因甚至顯示了比對p53基因更強的抑制效應。Pokemon作為ARF-Hdm2-p53-p21通路的主要控制因素，通過阻斷或限制ARF到Hdm2的表達，從而調節p53的表達最終影響到p21的表達。以上研究都證明了Pokemon是抑制多種抑癌基因從而使致癌基因發揮作用的上游關鍵基因，因此被喻為腫瘤發生的“總開關”，在致癌轉化中起了核心作用。因此，在人類腫瘤中檢測Pokemon的具體表達情況將具有重要意義。

目前國內外對Pokemon在人類腫瘤中的表達研究主要涉及淋巴瘤/白血病、非小細胞肺癌、乳腺癌及消化道惡性腫瘤等領域。Pokemon在腎癌中的表達及其與腎癌臨床病理特征的關系，就所查文獻尚未見詳細的研究和報道。本研究通過Real-time PCR方法，在mRNA（轉錄）水平檢測Pokemon在腎癌、癌旁、正常組織中的表達情況，及其與腎癌各臨床病理特征間的關系。結果顯示Pokemon的mRNA在所有的組織樣本中均存在表達，未發現Pokemon表達陰性的組織，且Pokemon的mRNA在腎癌、癌旁和正常組織中的表達總體有差異，具有統計學意義（P＜0.01）。經過進一步的組間兩兩比較發現，Pokemon的mRNA在腎癌中的表達明顯高于癌旁和正常組（P＜0.01），而癌旁和正常組差異無統計學意義（P＞0.05）。上述結果顯示Pokemon在腎癌中存在著異常的表達，提示其與腎癌的發生有關。王波、曹國春和徐靜等[7-9]分別在肝癌、賁門癌、白血病細胞和胃癌組織中檢測Pokemon的表達水平，均顯示了100％的表達率，且均發現Pokemon異常高表達于惡性腫瘤，與本研究結果一致。

對Pokemon的mRNA與腎癌各臨床病理特征間的關系進行統計分析顯示，Pokemon的mRNA表達與病理分級有關。低分化（3.262±0.905）、中分化（2.807±0.75）和高分化（2.501±0.559）組間總體差異具有統計學意義（P＜0.01）。由均數可見低分化組的mRNA表達最高，其中，低分化組與高分化組間差異有統計學意義（P＜0.01），與中分化組差異沒有統計學意義（P＞0.05），中分化組和高分化組之間差異有統計學意義（P＜0.05）。王鵬飛等[10]在大腸癌中的研究、張雨等[11]在胃癌中的研究以及李志明等[12]在非小細胞肺癌中的研究都認為Pokemon的表達和病理分級間存在相關性，具有統計學意義，與本研究結果相同。

Tsui KH等[13]根據1997年修訂的TNM分期標準對643例腎癌患者的相關預后因素進行分析后認為，病理分級和TNM分期是腎癌最重要的兩個預后指標，對偶然發現的無臨床癥狀的早期腎癌研究顯示，病理分級和患者存活率的相關性最大[14]。而本研究顯示Pokemon的表達和病理分級有關，因此推斷Pokemon在腎癌中的表達程度能預測腎癌的預后。Zhao ZH等[15]用免疫組化技術檢測62例非小細胞肺癌腫瘤組織中Pokemon的表達，發現Pokemon表達陰性的患者存活率顯著高于表達陽性的患者（P＜0.01），認為Pokemon的表達是一個獨立的影響預后的因子（P＜0.05），和本研究觀點一致。

本實驗納入的每例研究對象（患者）均在術畢按取材標準保存了癌、癌旁和正常對照3個標本，因此區組因素確定，在癌、癌旁和正常對照間統計Pokemon的表達差異時采用了隨機區組方差分析，充分考慮了不同個體間的差異對統計結果的干擾，較單因素方差分析具有明顯的優勢，在之后的統計結果中也證明了這一點，隨機區組方差分析顯示不同患者間Pokemon表達的差異也具有統計學意義（P＜0.01）。

綜上，Pokemon的mRNA在腎癌、癌旁和正常腎組織中普遍表達，而在腎癌中的表達明顯高于癌旁和正常組，且Pokemon的表達和病理分級有關。研究結果提示Pokemon的表達和腎癌的發生密切相關，可能預測腎癌的預后。為今后利用Pokemon進行腎癌的檢測診斷、預后判斷、甚至基因靶向治療提供了理論依據和新的思路。

[參考文獻]

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[6] Choi WI， Jeon BN， Yun CO， et al. Proto-oncogene FBI-1 represses transcription of p21CIP1 by inhibition of transcription activation by p53 and Sp1[J]. J Biol Chem， 2009，284（19）: 12633-12644.

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[14] Tsui KH， Shvarts O， Smith RB， et al. Renal cell carcinoma: prognostic significance of incidentally detected tumors[J]. J Urol，2000，163（2）：426-430.

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（收稿日期：2011-08-05）