Bmi-1\\P14及P16蛋白在結腸癌組織中的表達及其意義

[摘要] 目的 探討Bmi-1、P14及P16蛋白在結腸癌組織中的表達情況及其臨床意義。方法 選擇60份結腸癌組織標本及60份癌旁正常結腸組織，采用組化免疫方法染色，觀察Bmi-1、P14及P16蛋白的表達強度、陽性率及其相關關系。結果Bmi-1蛋白在結腸癌組織中表達強度、陽性率高于正常結腸組織，P14及P16蛋白在結腸癌組織中表達強度及陽性率低于正常結腸癌組織。相關性分析發現，結腸癌組織Bmi-1蛋白表達同P14及P16蛋白表達呈負相關關系（r=-0.419，P＜0.05；r=-0.372，P＜0.05），P14同P16蛋白表達呈正相關關系（r=0.537，P＜0.05）。結論Bmi-1蛋白在結腸癌組織過度表達，其可能對P14及P16蛋白的負向調控在結腸癌的發生及發展中發揮作用。

[關鍵詞] 結腸癌；Bmi-1蛋白；P14蛋白；P16蛋白

[中圖分類號] R735.3+5[文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）27-102-02

Expression and Significance of Bmi-1，P14 and P16 Proteinum in Colon Carcinoma Tissue

CAI Ke1NI Shichang2JIANG Sanya1SHI Bailing1

1.Department of Surgery，the Third Affiliated Hospital of Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang Province Zhongshan Hospital，Hangzhou 310005，China；2.Department of Anus，Rectum and Colon Surgery，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To investigate the clinical significance and expression of Bmi-1，P14 and P16 proteinum in colon carcinoma tissue. Methods Sixty tissues of colon carcinoma and sixty tissues of normal colon were selected and stain with immunizing histological chemistry way. Expression intensity and positive ratio of Bmi-1，P14 and P16 proteinum were detected and correlation between Bmi-1，P14 and P16 proteinum were analysized. Results Expression intensity and positive ratio of Bmi-1 were higher in tissues of colon carcinoma than in tissues of normal colon，expression intensity and positive ratio of P14 and P16 proteinum were lower in tissues of colon carcinoma than in tissues of normal colon， correlation test showed that there were negative correlation between Bmi-1 and P14，P16 proteinum （r=-0.419， P＜0.05；r=-0.372， P＜0.05），there was positive correlation between P14 and P16 proteinum（r=0.537， P＜0.05）. Conclusion Bmi-1 proteinum was over expression in tissues of colon carcinoma，that maybe have a effect in genesis and genesis of colon carcinoma by negative-going control to P14 and P16 proteinum.

[Key words] Colon carcinoma；Bmi-1 proteinum；P14 proteinum；P16 proteinum

結腸癌是臨床常見的消化系統腫瘤，結腸癌的發生是多因素長期作用的結果，腫瘤相關的細胞因子及蛋白表達異常與結腸癌的發生及進展密切相關，尤其與細胞周期密切相關的蛋白，在對細胞周期的調控過程中可能引起細胞的異常增殖，導致細胞永生化發生癌變，Bmi-1、P14及P16蛋白是與細胞周期密切相關的蛋白質，本文就其在結腸癌組織的表達及其相互關系進行研究，探討其在結腸癌的發生發展過程中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇我院2006年6月～2010年6月手術切除的結腸癌標本及腫瘤癌旁正常結腸組織各60份，其中結腸癌標本來源患者年齡37～84歲，平均（64.0±7.2）歲，正常結腸組織來源患者年齡35～81歲，平均（63.0±10.4）歲，兩組標本來源中患者年齡及性別無顯著差異，具有可比性。

1.2試劑及儀器

兔抗人多克隆Bmi-1、P14及P16抗體（南京建成生物工程研究所），SP、DAB超敏顯色試劑盒（武漢博士德生物工程研究所）。冰凍切片機（上海精密儀表廠），微波抗原修復儀（常州電子儀器廠），恒溫水浴箱（上海精密儀表廠），400目顯微鏡（北京儀器廠）。

1.3染色方法及觀察方法

結腸癌及正常結腸組織標本免疫組化染色方法采用三步SP法[1]，病理標本常規石蠟包埋，4μm厚度連續切片，展片機常規展片、烘干，微波修復抗原，抗雜質抗原采用非免疫山羊血清隔夜孵育后去除，采用PBS緩沖液沖洗后滴加一抗4℃孵育過夜，充分反應后PBS緩沖液沖洗三次，滴加生物素標記的二抗，37℃條件下恒溫孵育30min，充分反應后PBS緩沖液沖洗，然后滴加反應終止液終止反應，終止反應后自來水沖洗5min，采用DAB顯色，蘇木素復染，PBS緩沖液常規返藍，95%酒精脫水干燥、二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.4結果判斷

染色結果判斷采用計數法，采用400目光鏡下選擇5個不重疊的視野進行細胞計數，依據細胞染色情況。染色程度及染色細胞數量判定結果、淺棕色背景下視野內細胞不著色（－，陰性），棕色背景下視野內細胞淡藍或者褐色染色為陽性，5個視野內細胞染色計數，如果視野內陽性細胞數累加占全部細胞累加數目小于1/3（++，中等陽性），1/3~1/2分為（+++，中等陽性），大于1/2（++++）為強陽性。

1.5統計學處理

數據分析采用SPSS17.0漢語版統計學軟件處理，統計學方法率的比較采用χ2檢驗，相關性采用Spearman相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1Bmi-1、P14及P16蛋白在結腸癌組織的表達（表1）

結腸癌組織及正常結腸組織Bmi-1蛋白主要在細胞核及細胞漿表達，P14蛋白主要在細胞膜及細胞質表達、P16蛋白主要在細胞核表達、陽性表達者呈現棕黃色或黃褐色顆粒樣染色，Bmi-1、P14及P16蛋白在結腸癌組織表達陽性率分別為90.0%、23.3%及28.3%，在正常結腸組織表達陽性率分別為31.7%、76.7%及70.0%，結腸癌組織Bmi-1蛋白表達陽性率高于正常結腸組織，P14及P16表達陽性率低于正常結腸組織。

表1Bmi-1、P14及P16蛋白在結腸癌及正常結腸組織中的表達

[n（%）]

組織nBmi-1 P14 P16

結腸癌組織 60 54（90.0）14（23.3） 17（28.3）

正常結腸組織 60 19（31.7）46（76.7） 42（70.0）

χ2 8.26 6.91 5.42

P0.004 0.005 0.008

2.2 結腸癌組織Bmi-1蛋白與P14和P16蛋白表達相關關系（表2）

在結腸癌組織中，Bmi-1與P14蛋白同時陽性表達例數為12例，約為20.0%，同時陰性表達例數為4例，比例約為6.7%；在結腸癌組織，Bmi-1與P14蛋白表達呈現負相關關系（r=-0.419，P=0.002），在結腸癌組織，Bmi-1與P16蛋白同時陽性表達者14例，比例約為23.3%，同時陰性表達者3例，比例約為5.0%，在結腸癌組織，Bmi-1與P14蛋白表達呈現負相關關系（r=-0.372， P=0.021）。

表2結腸癌組織 Bmi-1蛋白與P14和P16蛋白表達相關性分析

Bmi-1P14合計P16合計

＋－＋－

＋ 12 42 54 144054

－24 63 3 6

合計144660 17 4360

2.3結腸癌組織P14與 P16表達的相關關系（表3）

在結腸癌組織，P14及P16蛋白同時陽性表達者為13例，比例約為21.7%，同時陰性表達者比例42例，比例約為70.0%，在結腸癌組織，P14同P16蛋白表達呈現正相關關系。

表3結腸癌組織P14與 P16表達的相關性分析

P14P16合計

＋－

＋13114

－ 4 4246

合計174360

3討論

結腸癌是常見的消化系統腫瘤，發病率較高，結腸癌的發生過程是抑癌因子與促癌因子失衡的過程，大部分與惡性腫瘤相關的細胞因子都與細胞周期密切相關，或者作用于細胞分裂周期關鍵的酶，引起細胞周期的異常，最終導致細胞增殖及凋亡機制的失衡，導致組織細胞惡變。Bmi-1、P14及P16蛋白均是與細胞周期密切相關的蛋白質，Bmi-1蛋白是Ploycomb組蛋白（Ploycomb-group，PcG）家族成員之一，PcG組蛋白在機體發育過程中發揮對控制基因活性的調節作用，在機體發生及發育過程中，其調節多種基因表達，PcG家族基因過度表達或發生突變時，都會引起機體發育異?；蚧?，甚至誘發腫瘤的形成。Bmi-1蛋白參與原始干細胞的分化、細胞周期調控以及衰老等生命過程[2]。在細胞的增殖、分化過程中起著主要作用，其與腫瘤的發生發展密切相關，Bmi-1蛋白可上調hTERT的轉錄，使端粒不能夠隨細胞的分化、增殖逐漸縮短，引起細胞的增殖活性增高，凋亡機制減弱，甚至引起細胞永生化，在細胞惡性轉化中起重要作用[3]，Bmi-1蛋白的過度表達可能是細胞惡變的始動機制之一。P14及P16蛋白是抑癌基因INK4a/ARF編碼的蛋白質，P16蛋白為細胞周期依賴性激酶抑制劑， P16蛋白主要作用于細胞G1期向S期的演進過程，能夠通過對CyclinD與CDK4/CDK6結合活性的調節，激活CDK4/CDK6，繼而促進轉錄因子合成，使細胞由G1期進入S期[4]，在此調節鏈中p16INK4a蛋白起著負反饋的作用，對細胞增殖周期起負性調節作用。一旦p16INK4a基因發生變異，將導致腫瘤的發生，P16的表達缺失甚至能夠作為腫瘤的早期事件對腫瘤的發生進行預測。P14為可變讀框基因（alter-ative reading frame，ARF），由外顯子1β、2和3編碼，由132個氨基酸組成，分子量為1390Da的蛋白質。p14ARF蛋白能穩定和提高細胞p53水平[5]，增強p53在G1/S期和G2/M期的限制點效應，最終使細胞阻滯于G1期和G2期，具有細胞周期負調控作用。

研究表明[6]，P14蛋白缺失的小鼠能夠形成腫瘤，表明 P14蛋白在腫瘤發生中可能起一定作用。在結腸癌組織的研究中發現，Bmi-1蛋白在結腸癌組織過度表達，而P14和P16蛋白存在明顯的表達缺失現象，說明Bmi-1、P14及P16蛋白共同參與直腸癌的發生過程。對結腸癌組織Bmi-1、P14及P16蛋白表達的進一步研究發現，在結腸癌組織Bmi-1表達同P14及P16蛋白表達呈現負相關關系，說明其可能通過對P14及P16蛋白表達的負性調控，進而使細胞凋亡機制失常，引起細胞的異常增殖。既往的研究也證實，Bmi-1基因轉導可抑制細胞的P16的表達，延長細胞的生存周期[7]。但在正常老化細胞中，Bmi-1并不下調P16蛋白表達，表明可能存在其與細胞增殖有關的Bmi-1靶點，在細胞凋亡抑制時靶點激活。研究結果也顯示，結腸癌的發生并非單一細胞因子或促癌因素引起的，而是多因素共同作用的結果，Bmi-1、P14及P16均參與結腸癌的發病過程并存在相互的調控關系。

[參考文獻]

[1] 黃秀娟，張喜，鄧昊. 免疫組化PV二步法與SP三步法比較[J]. 數理醫藥學雜志，2009，22（1）：27-28.

[2] 蘇進，許新華. 原癌基因 Bmi-1 與干細胞[J]. 山東醫藥，2011，51（4）：106-107.

[3] Vonlanthen S，Heighway J，Altermatt HJ，et al. The Bmi-1 oncoprotein is differentially expressed in non-small cell lung cancer andcorrelateswith INK4A/ARF locus expression[J]. Br J Cancer，2001，84（10）：1372-1376.

[4] Vernel lR，Helin K，Müller H. Identification of targetgenes of the p16 INK4A-pRB-E2F pathway [J]. J Biol Chem，2003，278（46）：46124 -46137.

[5] 陳軍，楊春，曹驥. P14ARF及P53蛋白在肝癌中的表達及相關性研究[J]. 廣西醫科大學學報，2008，25（4）：529-531.

[6] Kamijo T，Bodner S，van de Kamp E，et al. Tumor spectrum in ARE-deficient mice[J]. Cancer Res，1999，59（9）：2217.

[7] 黃虎，栗娜，胡義德，等. 2Bmi-1、cyclin D1、p16在胃癌中的表達及意義[J]. 重慶醫學，2009，38（5）：569-571.

（收稿日期：2011-07-07）