浙江省蕭山區輪狀病毒A組G型和P型基因同源性比較與進化分析

[摘要] 目的 分析浙江省蕭山區嬰幼兒急性腹瀉患者中分離的輪狀病毒A組G型、P型的基因序列，探討該病毒的遺傳變異和分子特性。方法收集2010年6～12月浙江省蕭山區急性嬰幼兒(≤5歲)腹瀉患者糞便標本，應用多重PCR技術從臨床標本中擴增輪狀病毒A組G型、P型基因片段并測序分析，比較基因的親緣關系并繪制進化樹。結果 162例糞便樣本，ELISA結果為54例陽性。PCR檢測結果 G1型為32株，G2為5株，G3為9株，P型中，P4為3株，P8為5株，成功地對16例A組輪狀病毒基因進行測序。2010年A組輪狀病毒基因的核苷酸序列與參考株具有較高的同源性，且A組基因核苷酸序列發生了一定的變異。結論 輪狀病毒A 是引起浙江蕭山地區急性腹瀉的主要的病原之一，其病原具有基因型別的多樣性，G1型可能是2010年浙江蕭山地區流行的優勢株。

[關鍵詞] 輪狀病毒；同源性；進化分析

[中圖分類號] R373.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）25-17-03

Analysis of Homology and Evolution of G and P Genotype of Rotavirus A Group in Xiaoshan of Zhejiang Province

ZHANG QunweiKONG JiangyingSHEN Limeng

Department of Clinical Lab， Xiaoshan Hospital in Zhejiang Province， Hangzhou 311201， China

[Abstract] Objective To analyze the gene sequence of rotavirus A group of G and P genotype from acute diarrhea patients in Xiaoshan district of Zhejiang Province and explore the virus genetic variation and molecular characteristics. MethodsCollect stool specimens of infants（≤5 years）with acute diarrhea in Xiaoshan district of Zhejiang Province from Jun 2010 to Dec 2010， and G and P genes of rotavirus A group from clinical specimens were amplified by multiplex RT-PCR， the amplified products with expected size were submitted to direct sequencing. Genetic factors were analyzed and drawn phylogenetic trees. Results Fifty-four cases of rotavirus A group gene were amplified from 162 cases of stool samples. 47 cases were G type， and 7 cases were P type. 32 strains were G1 type， 5 strains were G2 type， 9 strains were G3 type; 3 strains were P4 type， 5 strains were P8 type. 16 products with positive samples were successfully sequenced. After alignment， high homologies of amino acids of G and P genes were observed among sequences of rotavirus A group virus. However， some mutations of rotavirus A group were found in 2010. ConclusionRotavirus A viruses were one of the major pathogens causing acute diarrhea of infants （≤5 years）， multiple genotypes of Rotavirus A were found in the specimens， and G1 genotype was probably identified as the prevalent strain in Xiaoshan， Zhejiang province in 2010．

[Key words] Rotavirus; Homology; Evolution

輪狀病毒（Human Rotavirus ，HRV）是一種雙鏈核糖核酸病毒，屬于呼腸孤病毒科。它是嬰幼兒腹瀉的單一主因，幾乎世界上每個大約5歲的兒童都曾感染過輪狀病毒至少1次。輪狀病毒總共有7種，以英文字母編號為A、B、C、D、E、F與G。其中，A種是最為常見的一種。輪狀病毒由6種病毒蛋白質（viral protein，VP）架構了整個病毒顆粒（病毒體）。這些“結構性”的蛋白質分別被稱為VP1、VP2、VP3、VP4、VP6與VP7。VP7和VP4組成HRV的外部衣殼，二者都是中和抗原，可誘導機體產生中和抗體。目前根據HRV的主要外殼蛋白VP7和VP4中和抗原性的差異，A組HRV至少有16個G血清型和28個P基因型[1]。全球不同地區流行病學調查表明，G1、G2、G3、G4和G9是人類感染HRV最常見的流行優勢株[2]，而P型最常見的優勢株為P8和P4型[3]。本文分析了2010年6～12月浙江省蕭山區A組G型、P型輪狀病毒的發展趨勢。為嬰幼兒腹瀉的監測和防控提供重要依據，并為進一步進行分子生物學研究奠定基礎。

1#8195;材料與方法

1.1樣本來源

收集2010年6～ 12月浙江省蕭山醫院162例嬰幼兒（≤5歲）急性腹瀉就診患者的糞便標本。

1.2主要儀器和試劑

儀器：A組輪狀病毒ELISA 檢測試劑盒（DAKO）；S1000TM Thermal Cycler。試劑：Viral Nucleic Acid Extraction KitⅡ（Geneaid）；一步法RT-PCR試劑盒Takara One Step RNA PCR Kit（AMV）；DNA Marker DL2000、瓊脂糖均購自TaKaRa公司；普通梯度PCR儀Bio-Rad等。

1.3引物

利用DNAMAN 5.1.0.0軟件分析輪狀病毒不同毒株A組VP7基因和VP4基因的相對保守區域設計引物，并進行BLAST序列比對初步驗證引物特異性。G血清型PCR分型引物見表1，P基因型PCR分型引物見表2。

表1A組輪狀病毒G分型引物序列

引物G分型 位置 序列（5’---3’) 產物（bp）

Beg9 G(+) 1-28GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG

End9G(-) 1062-1036GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG1062

aAT8G8(+)178-198GTCACACCATTTGTAAATTCG 885

aBT1G1(+)314-335CAAGTACTCAAATCAATGATGG 749

aCT2G2(+)411-435CAATGATATTAACACCTTTTCTGTG652

aDT4G4(+)480-498CGTTTCTGGTGAGGAGTTG583

aET3G3(+)689-709CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG374

aFT9G9(+)757-776CTAGATGTAACTACAACTAC306

表2A組輪狀病毒P分型引物序列

引物G分型位置 序列（5’---3’) 產物（bp）

4Con3 P(+)11-32 TGGCTTCGCCATTTTATAGACA

4Con2 P(-) 868-887ATTTCGGACCATTTATAACC876

1T1 P[8]（-） 339-356 TCTACTTGGATAACGTGC345

2T1 P[4]（-） 474-494 CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC 483

3T1 P[6]（-） 259-278 TGTTGATTAGTTGGATTCAA267

4T1 P[9]（-） 385-402 TGAGACATGCAATTGGAC391

5T1 P[10]（-） 575-594 ATCATAGTTAGTAGTCGG594

1.4ELISA檢測輪狀病毒

嚴格按照人A組輪狀病毒ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，檢測糞便中的A組輪狀病毒。

1.5核酸的提取和PCR擴增基因

1.5.1核酸的提取 采用PBS溶液將糞便標本制備成10%的糞便懸液，離心后取200μL上清，根據Viral Nucleic Acid Extraction Kit Ⅱ（Geneaid）的操作說明書提取輪狀病毒的核酸RNA，核酸樣品的最終洗脫體積為50μL，分裝并保存于-70°C備用。

1.5.2G型PCR分型 一次擴增反應體系：Beg9（20μmol/L） 1μL，End9（20μmol/L） 1μL，病毒RNA 5μL，DEPC處理H2O 3μL，98℃變性5min，迅速置于冰內冷卻。在上述溶液中加入以下反應液：10×ExTaq Buffer5μL，dNTP（各10mmol/L） 1.6μL，ExTaq酶 0.25μL，AMV反轉錄酶（10U/μL） 0.2μL，DEPC處理H2O 32.95μL。

反應條件：42℃ 30min；94℃ 5min；30個循環（94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 1min）；72℃終延伸7min。

二次擴增反應體系：總反應體積25μL ，10× ExTaq Buffer 2.5μL，dNTP（各10mol/L） 0.8μL，ExTaq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.125μL，AT8（20μmol/L） 0.5μL，aBT1（20μmol/L）0.5μL，aCT2（20μmol/L） 0.5μL，aDT4（20μmol/L） 0.5μL，aET3（20μmol/L） 0.5μL，aFT9（20μmol/L） 0.5μL，End9（20μmol/L） 0.5μL，一次產物1μL，加H2O至25μL。

反應條件：94℃ 1min；30個循環（94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 1min）；72℃ 7min。

PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據DNA分子量標準判斷擴增條帶大小。

1.5.3 P型PCR分型 一次擴增反應體系：4Con2（20μmol/L）1μL，4Con3（20μmol/L） 1μL，病毒RNA 5μL，DEPC處理H2O 3μL，98℃變性5min，迅速置于冰內冷卻。在上述溶液中加入以下反應液：10×ExTaq Buffer2.5μL，dNTP（各10mmol/L） 1.6μL，ExTaq酶 0.25μL，AMV反轉錄酶（10U/μL） 0.2μL，DEPC處理H2O 32.95μL。

反應條件： 42℃ 30min；94℃ 5min，30個循環（94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 1min），72℃ 7min。

二次擴增反應體系：總反應體積25μL，10× ExTaq Buffer 2.5μL，dNTP（各10mol/L） 0.8μL，ExTaq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.125μL，1T1（20μmol/L） 0.5μL，2T1（20μmol/L） 0.5μL，3T1（20μmol/L） 0.5μL，4T1（20μmol/L） 0.5μL，5T1（20μmol/L） 0.5μL，4Con3（20μmol/L） 0.5μL，一次產物 1μL，加H2O至 25μL。

反應條件：94℃ 1min；30個循環（94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 1min）；72℃ 7min。

PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據DNA分子量標準判斷擴增條帶大小。

1.6基因序列測定和進化樹分析

將PCR產物委托上海生工生物技術有限公司對基因序列進行雙向測定。測序結果將引物序列去除后，應用DNAMAN（5.1.0.0）與Sequencher4.7軟件進行序列的拼接、比對和分析，利用MEGA4.0軟件（http://www.megasoftware.net/）與DNAstar 5.1對A組輪狀病毒VP7和VP4基因核苷酸序列進行同源性分析并繪制系統進化樹。所用參考毒株序列來源于GenBank。

2結果

2.1輪狀病毒A組基因的RT-PCR擴增結果

急性腹瀉患者的糞便樣本通過ELISA方法檢測，162例嬰幼兒患者腹瀉糞便標本中A組RV陽性54例，陽性率33.3%（54/162）。利用特異性引物對其進行RT-PCR擴增，擴增產物的電泳結果如圖1所示，此次擴增出G1、G2、G3、P4及P8型，目的條帶的大小與預期相符，其中G型最常見的是G1型，為32株，G2為5株，G3為9株，P型中，P4為3株，P8為5株。

圖1 A組輪狀病毒基因擴增結果：1.DL2000;2.G1型;3.G2型;4-5.G3型;6.G型陰性對照;7.P4型;8.P8型;9.P型陰性對照

2.2RT-PCR擴增產物的測序及序列拼接結果

選取G1型6株、G2型3株、G3型4株、P4型2株和P8型1株送上海生工生物技術有限公司對基因序列進行雙向測定，應用DNAMAN（5.1.0.0）與Sequencher4.7軟件進行序列的拼接、比對和分析。

2.3A組輪狀病毒基因核苷酸的同源性比較與進化樹分析

根據已報道的A組輪狀病毒基因核苷酸序列與2010年中部分A組輪狀病毒基因核苷酸的序列，利用MEGA4.0軟件與DNAstar 5.1對A組基因核苷酸序列進行同源性分析并繪制系統進化樹。

2.3.1A組輪狀病毒基因核苷酸的同源性比較和進化分析

2.3.1.1G型同源性比較和進化分析 通過對所測基因的核苷酸進行同源性比較和進化分析表明，13株G型輪狀病毒中G1型6株、G2型3株、G3型4株。其中G1型（46-RVA、51-RVA、50-RVA、17-RVA、85-RVA和34-RVA）基因核苷酸與GU377206.1、GU377196.1、AB534521.1、GU985236.1和GU985240.1的基因核苷酸序列同源性為94.6%～99.2%；G2型（65-RVA、79-RVA和69-RVA）基因核苷酸與HM066079.1、HM066080.1、HM467956.1的基因核苷酸序列同源性為92.7%～98.5%；G3型（162-RVA、87-RVA、24-RVA和91-RVA)基因核苷酸與HM773741.1、GU985255.1、AB525801.1、DQ873676.1的基因核苷酸序列同源性為95.8%~99.2%，見圖2。

2.3.1.2P型同源性比較和進化分析 通過同源性和進化分析的3株輪狀病毒P型中P4型2株、P8型1株。其中P4型（77-RVA-P和69-RVA-P）基因核苷酸與FJ623232.1、T76253.1、R88129.1、D61165.1、HM467941.1的基因核苷酸序列同源性為92.7%~99.4%；P8型（75-RVA-P）基因核苷酸與GU563717.1、HM773736.1、HQ230040.1、HQ230043.1、HQ230043.1的基因核苷酸序列同源性為93.9%~96.8%，見圖3。

圖2G型A組輪狀病毒基因核苷酸進化樹

3討論

輪狀病毒是世界范圍內引起嬰幼兒病毒性腹瀉的主要病原體，是引起嬰幼兒腹瀉的主要致病因子[4]，全世界每年約有60萬5歲以下兒童的死亡與RV有關。其中A組輪狀病毒是引起嬰幼兒非細菌性腹瀉的主要病原，根據全球不同地區流行病學調查，G1、G2、G3、G4和G9是人類感染HRV最常見的流行優勢株。而目前在世界范圍內常見的 P 基因型主要是 P8和 P4，我們所檢測出的P型A組輪狀病毒中，其流行株也主要是 P8和 P4 ，與國內其他地區報道一致。20世紀70～80年代的有關資料顯示，在世界各地RV的檢測陽性率為11％～70％，國內一些資料顯示，RV的一年陽性檢出率約40％～60％[5]。

本次研究的標本均為≤5歲的嬰幼兒，ELISA方法檢測RV陽性率為33.3%（54/162），PCR擴增出G1、G2、G3、P4及P8型，目的條帶的大小與預期相符，其中G型最常見的是G1型為32株，G2為5株，G3為9株，P型中，P4為3株，P8為5株?？梢娛捝降貐^的A組輪狀病毒以G1為主，其次為G3、G2、P8、P4 型，結果與我國其他地區，如重慶和上海地區報道一致[1，6]；而長春和河北省盧龍等地區的檢測結果中A組輪狀病毒以G3為主，其次為G1[7，8]。

另外，G9型自從1994年在北京地區被發現以來，相繼在我國其他地區被發現，如河北省盧龍，天津等地區，且呈現越來越多的趨勢[8，9]。本次研究當中未檢測出G9型，構建系統進化樹的13株標本核酸序列也與G9型參考株相比同源性很差，說明該型尚未在蕭山地區引起流行，但不能忽略此型的增長趨勢。

近幾年來，國際上A組輪狀病毒的分布在不同地區每年都會有變化。在一些亞洲國家，G1型流行優勢株存在被G3型和G9型取代的趨勢；如越南在2006 ～2007年的調查研究中顯示以G3型為主的流行優勢株[10]。在泰國的1993 ～2007年的長期綜合調查中，在總的結果中G1型為第一位，其次為G9 型；按年份分析，1993 ～1999年以G1型為主、2000 ～2003年以G9型為主、2003 ～2004年和2006 ～2007年又以G1型為主[10，11]。P型則仍以P8為流行優勢株，P6型雖在全球范圍內并不常見，但是近期研究表明P6型在我國云南、盧龍等地區也越來越常見[12，13]。針對A組輪狀病毒快速而多樣的變化趨勢，及時跟蹤調查和研究，對疾病的防治和疫苗的生產具有極大的意義。

本實驗室2010年6～12月對A組輪狀病毒的監測表明，蕭山地區的HRV感染G1亞型變異株是流行優勢株；P型則以P8、P4亞型變異株為主。由HRV引起的急性腹瀉患者中各個G、P亞型具有基因型別多樣性，這種特點可能增加了感染的概率和波及范圍。這些發現對我國病毒性腹瀉的預防和治療具有重要意義，對輪狀病毒疫苗的研究也有重要的價值。

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（收稿日期：2011-07-22）