MTA1基因?qū)m頸癌細(xì)胞HeLa侵襲轉(zhuǎn)移的影響

[摘要] 目的 探索MTA1基因與宮頸癌細(xì)胞HeLa侵襲遷移能力的關(guān)系。 方法 以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)的方法將含有MTA1全長基因的質(zhì)粒pEGFP-C1/MTA1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，應(yīng)用Western blotting檢測轉(zhuǎn)染效果，細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞黏附能力，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的變化，Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力的變化。結(jié)果 MTA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的宮頸癌HeLa細(xì)胞中，MTA1蛋白的表達(dá)、黏附能力、遷移及侵襲能力均明顯高于轉(zhuǎn)染空載體組及未轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）。結(jié)論 MTA1基因與宮頸癌細(xì)胞的侵襲遷移能力有關(guān)，MTA1基因可能成為宮頸癌治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1；宮頸癌；腫瘤轉(zhuǎn)移

[中圖分類號] R737.33[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1673-9701（2011）20-15-03

The Influence of MTA1 Gene in Invasion and Metastasis of Cervical Cancer

ZHU YimingYANG Zhengyan

Department of Gynecology Oncology，Zhejiang Cancer Hospital，Hangzhou 310022，China

[Abstract] Objective To study the relativity between MTA1 and invasion and migration of cervical cancer cells. Methods The plasmid pEGFP-C1/MTA1 inserted by the full length cDNA encoding human MTA1 gene was transiently transfected into HeLa cells by LipofectamineTM2000. The expression of MTA1 protein was investigated by Western blotting. Cell adhesion ability change was detected by cellular adhesive experiment. Migration rate was measured by wound healing assay. Furthermore，the abilities of cell invasion and metastasis were investigated using Transwell chambers. Results The cell adhesion，invasion and migration ability was increased after MTA1 over-expression mediated by pEGFP-C1/MTA1 transfection in HeLa cells（P＜0.05）. Conclusion Over-expression of MTA1 gene significantly increased the cell invasion，migration，and adhesion ability. MTA1 could serve as a potential therapeutic target in cervical cancer.

[Key words] Metastasis-associated 1；Cervical cancer；Tumor migration

宮頸癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率呈逐年上升的趨勢[1]。侵襲、轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌病死率及預(yù)后的主要因素[2-4]。研究表明，MTA1在許多腫瘤中都表達(dá)上調(diào)。MTA1基因?qū)儆诮M蛋白去乙酰基酶（HDAC）家族的一個(gè)成分，能夠通過改變組蛋白的乙酰化狀態(tài)進(jìn)行調(diào)控基因的表達(dá)，使得一些癌細(xì)胞向著更具有侵襲性的表型轉(zhuǎn)化。然而，MTA1在宮頸癌中的研究卻極少，因此我們選取了宮頸癌細(xì)胞HeLa檢測其MTA1的表達(dá)情況，并且觀察MTA1對其轉(zhuǎn)移、侵襲的影響。

1材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa購自美國典型物種保存中心（ATCC），置于含10%的胎牛血清、100U/mL鏈霉素及100U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基（購自Gibco公司），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h更新新鮮培養(yǎng)基。0.25%胰蛋白酶消化，收集并傳代。選取對數(shù)生殖期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。羊抗人MTA1多克隆抗體（1︰200），鼠抗人β-actin單克隆抗體（1︰1000）及二抗IgG（1︰1000）購自Santa Cruz公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，Transwell孔板購自美國Corning公司。PCR純化試劑盒購自美國Qiagen公司，基質(zhì)膠購自B.D.公司，PCR引物序列由廣州銳博生物公司合成。pEGFP-C1由山東大學(xué)分子生物實(shí)驗(yàn)室惠贈。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1正義全長MTA1真核表達(dá)載體的構(gòu)建并轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系HeLa根據(jù)MTA1基因序列，設(shè)計(jì)其全長表達(dá)引物并進(jìn)行PCR。提取人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴(kuò)增條件：94℃變性1min，56℃退火40s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，PCR純化試劑盒純化，與雙酶切后的pEGFP-C1載體黏端連接，轉(zhuǎn)化，測序，獲得正義表達(dá)載體pEGFP-C1/MTA1。MTA1全長表達(dá)引物序列如下：上游引物5’-AGCGTCACCCTGCTCAACGAGACCG-3’；下游引物5’-GGTTGGCCTCTGATGCAGACCACTC-3’。pEGFP-C1/MTA1送廣州銳博生物公司測序，鑒定為正確序列。按照LipofectamineTM2000說明書操作，將pEGFP-C1/MTA1及pEGFP-C1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，PBS作為空白對照。培養(yǎng)48h后，將細(xì)胞分為pEGFP-C1/MTA1組、pEGFP-C1組及對照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2Western blotting檢測Snail蛋白的表達(dá)取蛋白質(zhì)樣品上樣，以12%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離樣品，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫封閉后加入一抗羊抗人MTA1多克隆抗體（1︰200）、鼠抗人β-actin單克隆抗體（1︰1000），然后4℃孵育過夜，堿性磷酸酶標(biāo)記二抗IgG（1︰1000），37℃孵育1h，加入ECL，暗室曝光、顯影、定影。

1.2.3細(xì)胞黏附能力實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染48h后，于預(yù)鋪Matrigel（100μg/mL）的96孔板每孔中加入1×105細(xì)胞，設(shè)3個(gè)平行孔，分別在孵育20、40、60min后用PBS洗滌以除去未黏附的細(xì)胞。MTT法檢測570nm處的吸光度（A）值。黏附細(xì)胞比例（%）=黏附于Matrigel上細(xì)胞的A值/總細(xì)胞A值×100%。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染48h后，將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長到完全融合時(shí)，用200μL黃色槍頭在6孔板的底面上沿直線輕輕進(jìn)行劃痕，PBS沖洗2次后繼續(xù)培養(yǎng)，分別與8h、16h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕愈合情況并照相，以細(xì)胞劃痕愈合百分比表示細(xì)胞的運(yùn)動能力（0h的細(xì)胞劃痕愈合為0%）。

1.2.5Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，每個(gè)孔下室內(nèi)加入10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液500μL，上室加入200μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)12h。取出Transwell小室，95%乙醇固定，棉拭子擦去小室內(nèi)面的基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定，HE染色，顯微鏡下觀察并照相。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，結(jié)果以（χ±s）表示，兩組之間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染pEGFP-C1/MTA1后MTA1蛋白表達(dá)的改變

轉(zhuǎn)染后，pEGFP-C1/MTA1組MTA1蛋白的表達(dá)明顯高于pEGFP-C1組及對照組（P＜0.05），pEGFP-C1組和對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。各組的相對表達(dá)量見表1。

2.2細(xì)胞黏附能力檢測

細(xì)胞黏附能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞種植30min后黏附率pEGFP-C1/MTA1組明顯高于pEGFP-C1組及對照組（P＜0.05），pEGFP-C1組和對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組細(xì)胞種植30min后黏附率見表1。

2.3單層細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞的遷移能力

單層細(xì)胞受傷的24h內(nèi)只能靠細(xì)胞的移動來愈合，所以單層細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)可以反映細(xì)胞的遷移能力。單層細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，pEGFP-C1/MTA1組細(xì)胞的遷移速度明顯快于pEGFP-C1組及對照組（P＜0.05），pEGFP-C1組和對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。各組細(xì)胞的劃痕愈合百分比見表1。

2.4細(xì)胞侵襲能力的比較

Matrigel膠能在聚碳酸酯微孔濾膜表面形成類似基底膜的結(jié)果，所以細(xì)胞穿過Matrigel的情況可以反映出腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pEGFP-C1/MTA1組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于pEGFP-C1組及對照組（P＜0.05），pEGFP-C1組和對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。各組的穿膜細(xì)胞數(shù)見表1。

注：MTA1蛋白的表達(dá)：pEGFP-C1組與pEGFP-C1/MTA1組比較t=2.087，P＜0.05，對照組與pEGFP-C1/MTA1組比較t=2.081，P＜0.05；細(xì)胞黏附率：pEGFP-C1組與pEGFP-C1/MTA1組比較t=1.067，P＜0.05，對照組與pEGFP-C1/MTA1組比較 t=1.054，P＜0.05；細(xì)胞劃痕愈合百分比：pEGFP-C1組與pEGFP-C1/MTA1組比較t=2.101，P＜0.05，對照組與pEGFP-C1/MTA1組比較t=2.091，P＜0.05；穿膜細(xì)胞數(shù)：pEGFP-C1組與pEGFP-C1/MTA1組比較t=1.661，P＜0.05，對照組與pEGFP-C1/MTA1組比較 t=1.597，P＜0.05

3討論

MTA1基因是Toh等運(yùn)用差異cDNA文庫掃描技術(shù)從高轉(zhuǎn)移大鼠乳腺腺癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的，隨后用同源的方法發(fā)現(xiàn)了人的MTA1基因。除睪丸外的正常組織中，如心臟、肝臟、腦、肺臟、腎臟中MTA1都呈低水平表達(dá)，說明MTA1基因參與了正常細(xì)胞的增殖過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MTA1在多種惡性腫瘤組織中過表達(dá)，并且過表達(dá)的癌組織具有明顯的高侵襲率和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，容易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移[5，6]。符麗華等[7]運(yùn)用RT-PCR檢測了53例新鮮宮頸癌組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織MTA1 mRNA表達(dá)量明顯增高，并且與宮頸癌的臨床分期及轉(zhuǎn)移有關(guān)。但是目前在分子水平有關(guān)MTA1與宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移浸潤的研究鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選取了宮頸癌HeLa細(xì)胞為研究對象，對其轉(zhuǎn)入全長正義MTA1質(zhì)粒進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pEGFP-C1/MTA1組MTA1蛋白的表達(dá)較pEGFP-C1組和對照組明顯增強(qiáng)，并且pEGFP-C1/MTA1組較pEGFP-C1組和對照組細(xì)胞黏附率高、劃痕愈合能力強(qiáng)、穿膜細(xì)胞數(shù)多，說明pEGFP-C1/MTA1組在異質(zhì)間黏附能力、侵襲轉(zhuǎn)移能力方面均明顯增強(qiáng)，這與MTA1在其他惡性腫瘤中的研究結(jié)果一致。目前MTA1增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的具體機(jī)制尚不明確，但是明確的是MTA1蛋白能夠與組蛋白去乙酰化酶結(jié)合，去除組蛋白的乙酰基從而重塑染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因此MTA1能夠直接或者間接地作用于某些抑制腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的基因，下調(diào)其轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。

本研究中我們證實(shí)了MTA1與宮頸癌HeLa細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系，為宮頸癌分子轉(zhuǎn)移機(jī)制提出了理論依據(jù)，并且為宮頸癌的靶向治療提供了新的參考靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2011-05-09）

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