吸管法測定抗生素生物活性研究

摘 要:以大蒜素對土壤細菌、真菌的敏感性測定為例，研究了采用一次性無菌塑料吸管代替牛津杯測定抗生素生物活性的可行性，結果表明:吸管法可以測定抗生素的抑菌譜、最小抑菌濃度、生物效價，克服了牛津杯在反復使用中由于難于清洗造成的抗生素殘留與交叉污染問題，方法相對簡便、準確，試材來源廣泛、價格低廉，可供大中學校師生進行相關生物學教學實驗、科學研究時選用。

關鍵詞:吸管法管碟法抗生素生物測定方法改良

中圖分類號:Q939.9文獻標識碼:A文章編號:1674-098X(2011)07(a)-0001-01

抗生素生物測定是衡量抗生素生物活性的科學活動，國際通用的試驗方法是管碟法，它利用抗生素在瓊脂培養基內的擴散作用，比較標準品與供試品對接種菌產生抑菌圈的大小，以測定供試品效價或含量［1］。管碟法被我國歷版藥典收載，如2005年新版《中國藥典》(二部)應用管碟法進行含量測定的有氨基糖苷類、大環內酯類、青霉素類等78個藥品(包括原料及其制劑)［2］，是抗生素乃至化學殺菌劑進行微生物檢定的經典方法。

管碟法的實驗結果受多種因素的影響和制約，如抗生素供試樣品的制備來源、管碟的清潔滅菌、試驗菌種、培養條件等［3］。其中牛津杯(小鋼管)經過多次使用后，容易吸附抗生素或化學殺菌劑的殘留物，如果通過洗滌與高壓消毒滅菌都不能徹底破壞和消除，勢必影響下次抗生素生物測定的準確性［4］，難以克服人們對試驗結果的疑慮。因此，本試驗采用一次性無菌塑料吸管代替牛津杯對抗生素生物測定中的管碟法進行了改良研究。

1 材料和方法

1.1 供試土壤微生物來源

從我校食堂附近采集土樣，制作土壤稀釋懸液涂布平板，用平板劃線分離法純化培養單菌落，通過染色、鏡檢、形態特征鑒定，獲得細菌、真菌純培養菌株，供本研究抗生素生物測定的敏感菌株使用。

1.2 水浸提法制備大蒜素

大蒜頭去皮、洗凈、搗碎，加蒸餾水于25℃、35℃、43℃浸提40min，紗布過濾，3000r/min離心10min，上清液經濾紙過濾后再用0.2μm微孔濾膜過濾，得到2g/mL無菌大蒜素原液。用無菌蒸餾水稀釋到1g/mL、0.5g/mL備用。

1.3 吸管法測定土壤細菌、真菌對大蒜素的敏感性

取聚丙烯塑料吸管截成高10mm，內徑5mm的圓管，高壓蒸汽滅菌后代替牛津杯，以改良管碟法測定土壤細菌、真菌對大蒜素的敏感性。將0.1mL菌懸液涂布平板，其中細菌使用牛肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂15-20g，水1000mL，pH7.0-7.2)，真菌使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15-20g，水1000mL，pH自然)。把吸管無菌操作垂直插入培養基約1mm，用微量進樣器向吸管內注入l00μL大蒜提取液，置于28℃、37℃恒溫培養箱中培養1-5天，用游標卡尺測量抑菌圈大小。大蒜提取液2g/mL、1g/mL、0.5g/mL等3個濃度各做3組平行試驗，無菌蒸餾水作為空白對照。

2 結果與分析

試驗采用一次性無菌塑料吸管代替牛津杯測定土壤細菌、真菌對大蒜素的敏感性，呈現特定的抗菌譜，觀測到形態圓整、清晰的抑菌圈，部分結果如圖1所示。圖中吸管(1)與(7)是以無菌蒸餾水作為空白對照;吸管(2)(3)(4)都是0.5g/mL大蒜素，但產生的抑菌圈直徑差異較大，可能源于大蒜素制備不同引起，吸管(2)中樣品來自43℃浸提，而吸管(3)(4)中樣品來自35℃浸提，這說明制備方法對大蒜素活性成分的有效濃度存在影響，大蒜素的活性成分與浸提溫度有關，浸提溫度升高，大蒜素的活性成分有逐漸破壞的趨勢，與前人研究結果一致[5]。吸管(8)2g/mL大蒜素與(5)(6)1g/mL大蒜素相比，產生的抑菌圈直徑明顯較大。試驗采用的改良管碟法清晰揭示出抑菌圈的大小與大蒜素的濃度呈正相關，制備廣泛的濃度梯度范圍，即可確定大蒜素對特定敏感菌株的最小抑菌濃度(MIC)。同理，制備抗生素的標準曲線，可以測定供試樣品的效價或含量。

3 討論

作者提出并驗證了采用一次性無菌塑料吸管代替牛津杯對抗生素生物測定中的管碟法進行改良的可行性。以大蒜素對土壤細菌、真菌的敏感性測定為例進行了試驗研究，結果表明:吸管法可以測定抗生素的抑菌譜、最小抑菌濃度、生物效價，方法相對簡便。

“管碟法”是國際藥典普遍采用的經典檢定方法，本文雖以吸管代替牛津杯，但生物測定的原理仍屬“管碟法”的范疇，論文并沒有否定“管碟法”，而是試圖為發展“管碟法”提出的一種新思路。本文的創新之處是以塑料吸管代替牛津杯測定抗生素的生物活性，克服了牛津杯在反復使用中由于難于清洗造成的抗生素殘留與交叉污染問題［4］，從此角度來看就有提高生物測定準確性的可能性。

本文對“吸管法”作了初步探索，其方法論有待進一步研究、發展與完善。該法所需器材來源廣泛價廉，有利于較大規模的演示實驗降低成本并提高效率，因而適合大中學校進行相關生物學教學實驗采用，也可以初步篩選抗菌類藥品，其結果供進一步科學研究與質量檢定參考。

參考文獻

[1]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[S].北京:中國醫藥科技出版社，2000:377-380.

[2]中國藥典，2005年版[S].二部，2005:730.

[3]付長春.杯碟法影響抗生素效價測定的因素分析[J].西北藥學雜志，2008，23(5):310-311.

[4]田勝利.管碟法測定抗生素效價中的注意事項[J].黑龍江醫藥，2008，21(3):64.

[5]曾哲靈，熊偉，熊濤.大蒜素的提取工藝研究[J].食品與發酵工業，2006，32(2):121-123.