兩種生態型蚯蚓體腔液蛋白質組分的分析

摘要：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（ＰＡＧＥ）技術對兩種不同生態類型的微小雙胸蚓（Ｂｉｍａｓｔｕｓ ｐａｒｖｕｓ）和威廉環毛蚓（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｇｕｉｌｌｅｌｍｉ）體腔液進行了分離比較研究。不同生態類型的蚯蚓體腔液蛋白質電泳區帶數目和相對遷移率存在很大的差異。形成體腔液蛋白質組分的差異性可能與蚯蚓生態適應性有關。

關鍵詞：蚯蚓；體腔液；蛋白質組分；聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

中圖分類號：Ｓ８９９．８；Ｑ５０３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3866-03

Analysis on Protein Components in Ceolomic Fluid of Two Ecotypes of Earthworm

ＸＵ Ｘｉａｏ－ｙａｎ，ＨＥ Ｙｉｎｇ－ｓｅｎ，ＣＨＥＮＧ Ｄｏｎｇ，ＸＩＥ Ｊｉｎ－ｃｈｕａｎ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｉｃｈｕａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｅｏｌｏｍｉｃ ｆｌｕｉｄ’s ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｗｏ ｅｃｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｅａｒｔｈｗｏｒｍ， Ｂｉｍａｓｔｕｓ ｐａｒｖｕｓ ａｎｄ Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｇｕｉｌｌｅｌｍｉ， ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄ ｂｙ ＰＡＧＥ． Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｏｆ the ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｂｅｌｔ of ｃｏｅｌｏｍｉｃ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｅｃｏｔｙｐｅｓ． Ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ the difference of ｃｏｅｌｏｍｉｃ ｆｌｕｉｄ’s ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｍｉｇｈｔ ｄｕｅ ｔｏ ｅａｒｔｈｗｏｒｍ’s ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｄａｐｔａｂｉｌｉｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅａｒｔｈｗｏｒｍ； ｃｅｏｌｏｍｉｃ ｆｌｕｉｄ； ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ； ＰＡＧＥ

在自然生態中，蚯蚓通過吞食土壤中和地表的殘落物和有機物等，在攝取和排泄等生理活動的同時，將有機物和土壤混合，從而為加速降解有機物提供了可能［１－３］。由于蚯蚓常年生長于污穢的環境中，該特殊的生活環境促使其自身合成一些特殊的蛋白質以適應惡劣的環境，以形成生態適應性。在蚯蚓的生態適應性的表現形式上，蚯蚓的體腔液與蚯蚓抵御外來物質（細菌、真菌、病毒［４，５］、重金屬［６］、農藥［７］、獸藥［８］等）的侵害有直接的關系。而且在蚯蚓體腔液系統中，可能存在著一種被忽視了的、但卻十分有效的、能夠徹底殺滅病毒的獨特機制［９］。因此，對蚯蚓體腔液系統的研究不僅可能是對蚯蚓生態適應性形成的研究，而且，也可能是對蚯蚓在生存—環境適應—進化上進行研究的一個方向。隨著土壤污染尤其是重金屬對土壤的污染日益嚴重，對蚯蚓具有富集重金屬元素的能力的研究也發現，重金屬通常富集在蚯蚓體腔液中，尤其是Ａｓ在蚯蚓體腔液中的富集非常明顯［１０］。蚯蚓不僅可以作為土壤重金屬污染的重要指示生物，而且對被重金屬污染的土壤具有一定的凈化能力［１１］。研究選擇了表居型的微小雙胸蚓（Ｂｉｍａｓｔｕｓ ｐａｒｖｕｓ）和上食下居型的威廉環毛蚓（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｇｕｉｌｌｅｌｍｉ）的體腔液作為研究對象，比較和分析了生態類型不同的蚯蚓其體腔液中蛋白質組分的差異性，為進一步研究不同生態型蚯蚓殺滅病毒的機制以及對富集重金屬的能力和方式，也為根據體腔液蛋白質組分差異性對蚯蚓生態適應性形成的研究打下了基礎。

１材料與方法

１．１試驗材料

研究選用的蚯蚓品種為微小雙胸蚓（Ｂｉｍａｓｔｕｓ ｐａｒｖｕｓ）和威廉環毛蚓（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｇｕｉｌｌｅｌｍｉ），微小雙胸蚓和威廉環毛蚓均采自成都南郊農場的菜園土中。

１．１．１試劑［１２］丙烯酰胺（Ａｃｒ）；Ｎ，Ｎ－亞甲基雙丙烯酰胺（Ｂｉｓ）；四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）；核黃素：１％過硫酸銨（ＡＰＳ）；三羥甲基氨基烷（Ｔｒｉｓ）；甘氨酸（Ｇｌｙ）；０．００１ ｇ／ｍＬ溴酚藍。原染色液和固定液：０．２５ ｇ考馬斯亮藍Ｇ２５０溶于１ ０００ ｍＬ ０．０７ ｇ／ｍＬ乙酸水溶液。改進的染色液：１００ ｍＬ Ｈ２Ｏ加入１００ ｍＬ Ｈ３ＰＯ４，先混勻，再邊攪拌邊加１００ ｇ粉末狀（ＮＨ４）２ＳＯ４，溶解后加入１．２ ｇ 考馬斯亮藍Ｇ２５０再溶解，用水定容到８００ ｍＬ，邊攪拌邊加入２００ ｍＬ甲醇，終體積１ ０００ ｍＬ。改進的固定液：０．４ ｇ／ｍＬ甲醇＋０．１ ｇ／ｍＬ乙酸。改進的脫色液：甲醇∶水∶冰乙酸＝３∶６∶１（Ｖ∶Ｖ∶Ｖ）。

１．１．２儀器ＴＧＬ１６臺式高速冷凍離心機；ＤＹ－５０１型電泳儀；ＤＹＣＺ－２４Ｄ型電泳槽；ＡｃｅｒＳｃａｎ ６２０Ｐ掃描儀。

１．２試驗方法

１．２．１蚯蚓體腔液的制備［１３］取成熟的微小雙胸蚓和威廉環毛蚓放在濕濾紙上排糞２ ｄ，以消除蚯蚓糞對試驗結果的干擾，用ｐＨ為６．８的ＰＢＳ緩沖液反復沖洗干凈。用自制的５ Ｖ電壓瞬間刺激蚯蚓，用移液器收集黃色分泌液。４ ℃，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ，離心２０ ｍｉｎ，所得上清液為蚯蚓體腔液，置于－２０ ℃冰箱中保存，備用。

１．２．２聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）法

１）分離膠的制備。７％的聚丙烯酰胺凝膠（ｐＨ為８．９）。ｐＨ為８．９的ＴＥＭＥＤ液∶分離膠原液∶水＝１∶２∶１（Ｖ∶Ｖ∶Ｖ，５ ｍＬ為１份）。將上述混合溶液置于一燒杯中，另取一個燒杯裝４份ＡＰＳ（２０ ｍＬ），真空排氣泡將其立即混勻，裝入玻管中，膠高７ ｃｍ，膠表面覆蓋水３～５ ｍｍ。剛加水時看出有界面，后逐漸消失，等再次出現界面時，表明凝膠已經聚合，再靜置３０ ｍｉｎ，使聚合完全。

２）濃縮膠的制備。２．５％的聚丙烯酰胺凝膠（ｐＨ為６．７）。ｐＨ為６．７的ＴＥＭＥＤ液∶濃縮膠原液∶核黃素液＝１∶２∶１（Ｖ∶Ｖ∶Ｖ，１．５ ｍＬ為１份）。將上述混合溶液置于一燒杯中，另取一燒杯裝４份ＡＰＳ（６ ｍＬ），真空排氣泡將其立即混勻，吸去分離膠上覆蓋的水后，立即加注其上，膠高１ ｃｍ，膠表面覆蓋水３～５ ｍｍ，然后移至距日光燈管１０ ｃｍ處進行光聚合，當濃縮膠顯乳白色，表明聚合開始，繼續照射３０ ｍｉｎ，使聚合完全，除去水層，備用。

3）加樣。用微量進樣器吸取樣品液２０ μＬ加在膠面與電極緩沖液界面處。為了達到良好的分離效果，先要吸干凝膠柱頂部的水，并用電極緩沖液沖洗膠面和膠底３次，除氣泡。電泳槽上接正極，槽下接負極。

4）電泳。當加入樣品后，在開始電泳時，電壓、電流調至最低，待樣品進入濃縮膠后，加大電流到每管３ ｍＡ；樣品進入分離膠后，電流調至每管４ ｍＡ。當溴酚藍下降到距膠底１ ｃｍ時停止電泳，取出剝膠。

5）固定。用改進的染色方法［１４］固定，將取出的凝膠柱浸泡在改進的固定液中固定３０ ｍｉｎ。

6）水洗，水洗膠１５ ｍｉｎ，４次重復。

7）染色。浸泡在改進的染色液中染色１ ｈ。

8）脫色。采用改進的脫色方法［１5］，用改進的脫色液脫色４次，每次５ ｍｉｎ，就可看到清晰的背景。

２結果與分析

經過５次重復取樣、電泳、控制條件，將兩種蚯蚓體腔液樣品進行電泳比較，所得到的體腔液蛋白質的電泳區帶見圖１。

從電泳區帶和掃描曲線（圖2、圖3）看，微小雙胸蚓體腔液的５次電泳結果均能重復，能清晰地分出６條帶；威廉環毛蚓體腔液的５次電泳結果均能重復，能清晰地分出９條帶（見表１）。

微小雙胸蚓和威廉環毛蚓體腔液的電泳區帶的比較發現這兩種生態類型的蚯蚓體腔液蛋白質組分差異性很明顯。蚯蚓體腔液蛋白質組分差異性一方面反映了不同種蚯蚓之間的差異性，另一方面也可能反映出蚯蚓的生存—環境適應—進化的一種結果。

３討論

由于體腔液蛋白質是動物體內一類生物大分子物質，它的合成受基因控制，具有顯著的種屬特異性。在生物進化過程中，它的生化表現型不斷會有突變發生。電泳行為（泳動速度）和電泳區帶數目的變化可能隱藏著其進化的歷史。蚯蚓有較強分解有機物的能力和環境適應能力，以表居型蚯蚓最強［１6］。通過比較兩種生態類型不同的蚯蚓體腔液蛋白質組分的差異性發現，上食下居型蚯蚓體腔液蛋白質組分比表居型蚯蚓復雜，這可能是與蚯蚓生態類型有關。從蚯蚓生態適應性的食性上看，表居型蚯蚓生活和取食都在地表的枯枝落葉層，主要以植物殘落物為食；上食下居型蚯蚓生活在土壤亞表層，偏愛分解土壤中腐爛狀態的有機殘體。表居型蚯蚓往往能更直接地接觸到重金屬、農藥、獸藥；上食下居型蚯蚓不僅要接觸到重金屬、農藥、獸藥，而且常以分解土壤中腐爛狀態的有機殘體為食，其體內的殺滅病毒的機制也可能與表居型蚯蚓有所不同。蚯蚓體腔液系統中蛋白質組分的差異可能反映了不同生態類型的蚯蚓在這兩個方面生態適應性的一種表現特征。

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