羊棲菜乙醇提取物的抗氧化活性

摘要：用體積分數７０％的乙醇浸提羊棲菜（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）得到粗提物，將粗提物溶于去離子水再依次用有機溶劑萃取，得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃取后剩余物，測定粗提物和各萃取物的總多酚含量、維生素Ｃ和維生素Ｅ含量以及還原力。結果表明，正丁醇萃取物中的總多酚和維生素Ｅ含量較高，正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物具有較強的還原力。

關鍵詞：羊棲菜（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）；抗氧化活性；總多酚；ＤＰＰＨ·

中圖分類號：Ｑ９４９．２８＋８．５；Ｒ２８４．２ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）22－4695-03

Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｏｆ Ｅｔｈａｎｏｌ Ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ

ＹＥ Ｈｏｎｇ１，ＺＨＯＵ Ｃｈｕｎ－ｈｏｎｇ２，GAO Bei-lei2，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｑｉｎｇ１，ＺＥＮＧ Ｘｉａｏ－ｘｉｏｎｇ１，ＹＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｈｕａ１，ＲＥＮ Ｄｅ－ｋａｎｇ１

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｊｉａｎｇｓｕ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００３６，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔ （ＣＥ） ｏｆ Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ７０％ ｅｔｈａｎｏｌ ａｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｓｏｌｖｅｎｔ， ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｂｙ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ （Ｃｆ）， ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ （ＥｔＯＡｃ）， ａｎｄ ｎ－ｂｕｔａｎｏｌ （ｎ－ＢｕＯＨ） ｏｒｄｅｒｌｙ； Fｏｕｒ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｆ， ＥｔＯＡｃ， ｎ－ＢｕＯＨ ａｎｄ ａｑｕｅｏｕｓ were ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ， ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ａｎｄ Ｅ ｉｎ ＣＥ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｅｎｔs ｏｆ ｔｏｔａｌ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ａｎｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ were ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｎ－ＢｕＯＨ ｆｒａｃｔｉｏｎ； Wｈｉｌｅ ｎ－ＢｕＯＨ ｆｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＥｔＯＡｃ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｈｉｇｈｅｒ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ｔｏｔａｌ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ； ＤＰＰＨ·

羊棲菜（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）屬褐藻門馬尾藻科，是暖溫帶－亞熱帶性海藻，主要生長在太平洋北部，在我國廣大海域都能生長。酚類化合物廣泛存在于此類植物中，具有多種保健功能，其中最重要的是抗氧化功能。它不僅對活性氧自由基具有很強的捕捉能力，而且可以對由氧自由基誘發的生物大分子損傷起到保護作用，具有明顯的抗突變、抗腫瘤、抗病毒、抗微生物、抗衰老等功能［１－６］。關于海藻中水、醇或脂溶性溶劑提取物的抗氧化活性報道甚多。研究表明褐藻多酚具有很強的自由基清除能力，是一類在藥學、食品和日化等領域很有使用前景的天然抗氧化劑和自由基清除劑［７，８］。國內有關羊棲菜中的多酚和抗氧化活性的研究較少。因此，以羊棲菜為原料，對其萃取物總多酚、維生素含量及抗氧化活性進行系統分析，可為羊棲菜的綜合利用提供理論依據。

１材料與方法

１．１材料

羊棲菜：購于山東威海青正食品有限公司。

試劑：ＤＰＰＨ·（１，１－二苯基苦基苯肼）購于美國Ｓｉｇｍａ公司，Ｆｏｌｉｎ－Ｄｅｎｉｓ試劑、維生素Ｃ（ＶＣ）和維生素Ｅ（ＶＥ）試劑盒購于南京建成生物工程研究所，其余試劑均為國產分析純。

試驗儀器：植物粉碎機（荷蘭Ｐｈｉｌｉｐ公司），電子天平ＢＳ２１０Ｓ（北京塞多利斯儀器系統有限公司），數顯恒溫水浴鍋ＨＨ－６（常州國華電器有限公司），旋轉蒸發儀（德國Ｈｅｉｄｏｌｐｈ公司），臺式離心機Ａｎｋｅ ＴＤＬ－５（上海安亭科學儀器廠），７２２Ｓ可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），冷凍干燥機ＡＬＰＨＡ １－２（德國Ｍａｒｔｉｎ Ｃｈｒｉｓｔ公司）。

１．２方法

１．２．１羊棲菜粗提物和各萃取物的制備取羊棲菜２００ ｇ，清水洗凈剪碎，在３０ ℃烘箱中烘干，用植物粉碎機打成粉末，用２ Ｌ ７０％（體積分數，下同）的乙醇浸提。離心后取上清液，真空濃縮，凍干得粗提物，將粗提物溶于去離子水，再依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮凍干，分別得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃取后剩余物，流程見圖１。

１．２．２總多酚含量的測定（Ｆｏｌｉｎ－Ｄｅｎｉｓ法）［９］標準曲線的制作：稱取２５．０ ｍｇ間苯三酚，用去離子水完全溶解，定容至２５ ｍＬ容量瓶中，配制成濃度為１．０ ｍｇ／ｍＬ的間苯三酚溶液，分別取０、０．０５、０．１５、０．２５、０．３５、０．４５ ｍＬ間苯三酚溶液，加去離子水稀釋至７ ｍＬ混合均勻，加入１ ｍＬ Ｆｏｌｉｎ－Ｄｅｎｉｓ試劑搖勻，３ ｍｉｎ后加入２ ｍＬ ０．７ ｍｏｌ／Ｌ的Ｎａ２ＣＯ３溶液，混合充分測定７１０ ｎｍ處吸光度，以吸光度為縱坐標，間苯三酚濃度為橫坐標作圖，得標準曲線。樣品總多酚含量的測定：將粗提物和各萃取物配成適當濃度的溶液，按上述步驟操作，測定７１０ ｎｍ處吸光度，樣品中總多酚含量以每克干重含有的間苯三酚含量表示，單位是ｍｇ／ｇ。

１．２．３ＶＣ和ＶＥ含量的測定（啡羅啉法）粗提物和各萃取物中ＶＣ和ＶＥ的含量使用試劑盒測定。

１．２．４ＤＰＰＨ·清除率的測定將０．１ ｍＬ無水乙醇與３ ｍＬ ＤＰＰＨ·無水乙醇溶液（１×１０－４ｍｏｌ／Ｌ）混合，搖勻，以無水乙醇調零，測５１７ ｎｍ處的吸光度Ａ０。再將０．１ ｍＬ樣品溶液（稀釋至不同濃度）與３ｍＬ ＤＰＰＨ·無水乙醇溶液混合，搖勻，３０℃暗處反應３０ ｍｉｎ，測５１７ ｎｍ處的吸光度Ａ１，以綠原酸（ＣＨＡ）作陽性對照。同時作樣品空白試驗，即將０．１ ｍＬ樣液與３.0 ｍＬ無水乙醇混合，按上述條件進行同樣的操作，測定５１７ ｎｍ處的吸光度Ａ２。對ＤＰＰＨ·清除率的計算公式：清除率＝［１－（Ａ１－Ａ２）／Ａ０］×１００％。

１．２．５Ｈ２Ｏ２清除率的測定取不同濃度樣品溶液１．０ ｍＬ于試管中，分別加入２．４ ｍＬ磷酸鹽緩沖液（０．１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．４）和０．６ ｍＬ Ｈ２Ｏ２溶液（４０ ｍｍｏｌ／Ｌ），混勻，反應１０ｍｉｎ后，測２３０ ｎｍ處的吸光度Ａ１，以ＶＣ作陽性對照。以去離子水代替樣液，按上述條件進行同樣的操作，測２３０ ｎｍ處的吸光度Ａ０，同時做樣品空白試驗，即以去離子水代替Ｈ２Ｏ２溶液，按上述條件進行同樣的操作，測２３０ ｎｍ處的吸光度Ａ２。以去離子水代替樣液和Ｈ２Ｏ２溶液，做參比試驗調零用。對Ｈ２Ｏ２清除率的計算公式：清除率＝［Ａ０－（Ａ１－Ａ２）］／Ａ０×１００％。

１．２．６還原力的測定取不同濃度樣品溶液１．０ ｍＬ于試管中，分別加入１．０ ｍＬ磷酸鹽緩沖液（０．２ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ６．６）和１．０ ｍＬ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６溶液（０．０３ ｍｏｌ／Ｌ），混勻，５０ ℃水浴２０ ｍｉｎ，取出后迅速冷卻，加１．０ ｍＬ三氯乙酸溶液（０．６ ｍｏｌ／Ｌ），混勻，再加０．２ ｍＬ ＦｅＣｌ３溶液（６ ｍｍｏｌ／Ｌ），混勻，１０ｍｉｎ后于７００ ｎｍ處測其吸光度Ａ１，以ＶＣ作陽性對照。同時做樣品空白試驗，以去離子水代替ＦｅＣｌ３溶液，于７００ ｎｍ處測其吸光度Ａ２。以去離子水代替樣液和ＦｅＣｌ３溶液做參比試驗調零用。以吸光度（Ａ１－Ａ２）表示樣品的還原力。吸光度越大，表明還原力越強。

２結果與分析

２．１羊棲菜粗提物及各萃取物的得率

羊棲菜經70%乙醇浸提后得到粗提物，粗提物依次用不同有機溶劑萃取后得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及萃取后剩余物，將其濃縮凍干，粗提物及各萃取物的得率（質量比）、總多酚含量、ＶＣ和ＶＥ含量見表１。由表１可知，氯仿萃取物和萃取后剩余物的得率較高，而乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的得率較低。正丁醇萃取物的總多酚含量較高，乙酸乙酯萃取物、粗提物和萃取后剩余物中的總多酚含量較接近，氯仿萃取物中的總多酚含量較低。萃取后剩余物中的ＶＣ較高，各萃取物的ＶＥ含量為：正丁醇萃取物＞萃取后剩余物＞乙酸乙酯萃取物＞氯仿萃取物＞粗提物。

２．２ＤＰＰＨ·的清除率

ＤＰＰＨ·是一種穩定的自由基，廣泛用于評價抗氧化物質的清除自由基活性。ＤＰＰＨ·具有單電子，在５１７ ｎｍ處有強吸收（呈深紫色），當有自由基清除劑存在時，自由基清除劑與其單電子配對而使其光吸收逐漸消失，其退色程度與其所接受的電子數成定量關系，因而可用分光光度法進行定量分析。粗提物及各萃取物對ＤＰＰＨ·的清除率見圖２。

由圖２可見，正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物在低濃度時對ＤＰＰＨ·的清除率較高，而氯仿萃取物和萃取后剩余物對ＤＰＰＨ·的清除率較低。粗提物和各萃取物的清除率均隨著濃度的增加而增加。特別是粗提物對ＤＰＰＨ·的清除率隨濃度的變化較明顯。陽性對照綠原酸在濃度為０．１ ｍｇ／ｍＬ時對ＤＰＰＨ·清除率為２９．８１％。

２．３Ｈ２Ｏ２的清除率

Ｈ２Ｏ２在２３０ ｎｍ處有最大吸光度，若與樣品反應，其吸光度將會降低，因此其吸光度越低，表明樣品清除Ｈ２Ｏ２的能力越強。粗提物及各萃取物對Ｈ２Ｏ２的清除率見圖３。由圖３可見，在濃度大于０．５ ｍｇ／ｍＬ時，正丁醇萃取物對Ｈ２Ｏ２的清除率最高，其次是氯仿萃取物，萃取后剩余物和乙酸乙酯萃取物對Ｈ２Ｏ２的清除率較低。粗提物及各萃取物對Ｈ２Ｏ２的清除率隨濃度的變化不太明顯。陽性對照ＶＣ在濃度為０．５ ｍｇ／ｍＬ時對Ｈ２Ｏ２的清除率為９２％。

２．４還原力的測定

還原力測定的原理即樣品能將赤血鹽［Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６］還原成黃血鹽［Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６］，黃血鹽再與Ｆｅ３＋作用，生成普魯士藍，在７００ ｎｍ波長測定吸光度，以檢測普魯士藍的生成量，Ａ７００ ｎｍ越高，表示樣品還原力越強。圖４顯示了粗提物及各萃取物的還原力。由圖４可見，在相同濃度時，粗提物及各萃取物的還原力為：乙酸乙酯萃取物＞粗提物＞正丁醇萃取物＞萃取后剩余物＞氯仿萃取物。粗提物及各萃取物的還原力均隨著濃度的增加而提高，而氯仿萃取物的還原力隨樣品濃度的增加時變化較小。陽性對照ＶＣ在濃度為８ μｇ／ｍＬ時Ａ７００ ｎｍ為０．３６４。

３小結

１）羊棲菜的氯仿萃取物和萃取后剩余物的得率較高，而乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的得率較低。正丁醇萃取物中總多酚含量較高，為２６．３８ ｍｇ／ｇ，正丁醇萃取物中ＶＥ含量最高，萃取后剩余物中ＶＣ含量最高。

２）測定了羊棲菜粗提物和各萃取物的還原力，結果表明正丁醇萃取物具有較好的清除ＤＰＰＨ·的能力和清除Ｈ２Ｏ２的能力，乙酸乙酯萃取物的還原力較強。正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物的還原力較強，這可能與萃取物中含有較多的活性總多酚有關。

參考文獻：

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