DAPK基因啟動子區(qū)過甲基化與頸段食管癌的關(guān)系

【摘要】目的 探討死亡相關(guān)蛋白激酶基因啟動子區(qū)過甲基化與頸段食管癌的關(guān)系。方法 采用甲基化特異性PCR（MSP）法和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法分析頸段食管部正常黏膜、頸段食管癌及相應(yīng)癌旁組織中DAPK基因啟動子區(qū)過甲基化及其mRNA表達(dá)狀況。結(jié)果 42例頸段食管癌組織中，有27例(64.3%)DAPK基因啟動子區(qū)過甲基化，其在各病理分級和T分級之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而在N分級之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。25例癌旁組織中，有6例過甲基化，且均為頸段食管癌組織中有過甲基化的病例。頸段食管部正常組織、非甲基化的頸段食管癌組織和癌旁組織中均有DAPK mRNA表達(dá)。結(jié)論 頸段食管癌中DAPK基因啟動子區(qū)過甲基化與mRNA失表達(dá)有關(guān)，可能是頸段食管癌發(fā)生、發(fā)展的原因之一。

【關(guān)鍵詞】頸段食管腫瘤；蛋白激酶類/遺傳學(xué)；基因表達(dá)；DNA甲基化

死亡相關(guān)蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）是一種鈣離子和鈣調(diào)素依賴的絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶，它參與干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α、Fas等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，具有促進(jìn)凋亡的功能［1］。DAPK的正常表達(dá)可抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)，在一些惡性細(xì)胞株或腫瘤組織中，DAPK表達(dá)缺失或極少表達(dá)，可能與其基因啟動子區(qū)CpG島過甲基化有關(guān)。為探討抑癌基因DAPK啟動子區(qū)CpG島過甲基化與頸段食管癌的關(guān)系，筆者觀察了頸段食管部正常組織、頸段食管癌及相應(yīng)癌旁組織中DAPK基因啟動子區(qū)過甲基化及其mRNA表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 42例頸段食管癌及相應(yīng)癌旁組織來源于筆者所在醫(yī)院手術(shù)切除的標(biāo)本，25例癌旁組織取自腫瘤邊緣5 mm外區(qū)域，為肉眼下正常組織，且病理檢查未見癌細(xì)胞浸潤。5例頸段食管部正常組織來自頸段食管外傷手術(shù)修復(fù)的患者。頸段食管部組織切除后，立即放入－70 ℃冰箱中備用。42例頸段食管癌患者中，男34例，女8例。年齡最小者32歲，最大者78歲，平均53.4歲。術(shù)前均未經(jīng)化療或放療。全部頸段食管癌組織經(jīng)病理診斷均為鱗狀細(xì)胞癌，其中高分化17例，中分化10例，低分化15例。按1997年國際抗癌協(xié)會TNM標(biāo)準(zhǔn)，T1期7例，T2期9例，T3期15例，T4期11例，N0期29例，N1期13例。

1.2 主要試劑及儀器 基因組DNA修飾試劑盒購于美國Intergen公司；TRIzol試劑購于GIBCO公司；逆轉(zhuǎn)錄酶MLV為Promega公司產(chǎn)品。PCR儀為9600型，成像系統(tǒng)為Grab-it 4.0，分析軟件為Gelworks 1 D interdiate。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取和亞硫酸氫鈉修飾 DNA提取用酚氯仿抽提法。取1 μg DNA，用基因組DNA修飾試劑進(jìn)行修飾。

1.3.2 甲基化特異性PCR DAPK基因的擴(kuò)增用甲基化特異性PCR（MSP）法。甲基化引物：5-GGA TAG TCG GAT CGA GTT AAC GTC-3 (上游)，5-CCC TCC CAA ACG CCG-3（下游）；非甲基化引物：5-GGA GGA TAG TTG GAT TGA GTT AAT GTT-3（上游），5-CAA ATC CCT CCC AAA CAC CAA-3（下游）。反應(yīng)條件為：95 ℃、5 min，然后95 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40個循環(huán)后，72 ℃、5 min。反應(yīng)體系（25 μl）含模板約0.1 μg、0.4 μmol各引物、0.2 mmol dNTP、10 mmol 2-巰基乙醇、Mg2+ 1.5 mmol、1.0 UTaqDNA聚合酶、10×反應(yīng)緩沖液2.5 μl（含硫酸氨）和適量水。為保證檢測的可靠性，以正常人外周血淋巴細(xì)胞DNA，經(jīng)SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理過的胎盤DNA和水，分別做非甲基化與甲基化的陽性對照和空白對照。取10 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相。

RNA提取及RT-PCR檢測mRNA：?。?0 ℃存放的上述組織，每份約50 mg，用1 ml TRIzol（按說明書操作）逐步提取總RNA。CDNA第一鏈合成體系為25 U，每份取總RNA 2 μg，用逆轉(zhuǎn)錄酶MLV、oligodT以及相關(guān)試劑按說明配成適當(dāng)濃度，合成cDNA。

根據(jù)GenBank中DAPK mRNA序列，用primer premier 5.0設(shè)計引物：5-GCC TGG AGA CGG AGA AGA T-3(上游)，5 -AAG TCC CGT GGC TGG TAG A-3（下游），內(nèi)參照－actin的引物：5-GTG CGT GAC ATT AAG GAG-3（上游），5-CTA AGT CAT AGT CCG CCT-3（下游）。為了確保內(nèi)參和目的基因的可比性，用primer dropping法（6）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即在擴(kuò)增前先找出各自的平臺期，使反應(yīng)終止于平臺期之前的指數(shù)增長期。PCR反應(yīng)體系（25 μl）中含模板cDNA 2.5 μl、10 Buffer 2.5 μl、Mg 1.5 mmol、dNTP 0.4 mmol、0.3 μmol各引物，1 U Taq DNA聚合酶和適量水。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃ 45 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s。先加入DAPK基因引物，程序運(yùn)行6個循環(huán)后再加入－actin引物，共28個循環(huán)，然后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μl產(chǎn)物，用1.5％瓊脂糖凝膠（內(nèi)含EB）電泳，然后用grab-It成像系統(tǒng)照相并分析各條帶的吸光度值，以目的基因?qū)Ζ?catin的相對累積光密度值記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，DAPK基因啟動子區(qū)甲基化與各臨床資料之間的關(guān)系用χ2檢驗，非甲基化的癌組織、癌旁及正常頸段食管部組織中mRNA表達(dá)的差異用方差分析。

2 結(jié)果

42例頸段食管癌組織中，有27例過甲基化，甲基化率為64.3%，甲基化產(chǎn)物為98 bp；5例正常頸段食管部組織均無DAPK基因甲基化；25例癌旁組織中，有6例發(fā)生甲基化，且均為相應(yīng)癌組織中有甲基化的病例。DAPK基因過甲基化在頸段食管癌各病理分級和T分期間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而在N分期（N0和N1）間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。RT-PCR檢測結(jié)果示，所有甲基化的腫瘤組織中均無DAPK mRNA表達(dá)，而5例正常組織、19例癌旁組織和15非甲基化的頸段食管癌組織中均有其mRNA的表達(dá)，差異無顯著性（P=0.332）。

3 討論

目前的研究認(rèn)為，DNA甲基化是一種新的基因調(diào)控機(jī)制，即基因序列不發(fā)生變化而基因表達(dá)受影響。DNA甲基化多數(shù)位于CpG島（CpG二核苷酸聚集區(qū)），而CpG島多集中分布于基因5端啟動子區(qū)域。基因啟動子區(qū)CpG島過甲基化可通過抑制其轉(zhuǎn)錄，使該基因失活。Baylin等［2］研究發(fā)現(xiàn)，有多種抑癌基因的失活與其5端啟動子區(qū)CpG島過甲基化有關(guān)。MSP技術(shù)敏感性高，且特異性強(qiáng)，假陽性極少見。筆者采用MSP法，檢測了頸段食管癌中DAPK基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。

DAPK是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的正向調(diào)控因子，參與多種細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)途徑，包括干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α、FAS、p53［3］和TGF-β［4］等。DAPK的表達(dá)缺失與其基因啟動子區(qū)域CpG島高頻率過甲基化在造血系統(tǒng)惡性腫瘤［5］、結(jié)腸直腸癌［6］、前列腺癌［7-8］、膀胱癌［9］、胃癌［10］、頭和頸腫瘤以及其他一些實體瘤中被發(fā)現(xiàn)。Jeong等［11］采用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中p16及DAPK的甲基化陽性率分別為57%及44.9%，較正常宮頸組織明顯升高。目前有關(guān)Barrett食管腺癌的研究中，檢測正常食管黏膜及食管腺癌的DAPK基因過甲基化率分別為20%和60%，并且發(fā)現(xiàn)DAPK啟動子的異常甲基化與DAPK蛋白的表達(dá)下降密切相關(guān)，而低表達(dá)DAPK的癌灶分級分期更高［12］。

本研究結(jié)果顯示，頸段食管癌中DAPK基因啟動子區(qū)CpG島過甲基化與其轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)，可能是頸段食管癌發(fā)生的原因之一。在部分癌旁組織中也發(fā)現(xiàn)有甲基化，說明DAPK基因啟動子區(qū)CpG島過甲基化可能是頸段食管癌發(fā)生和發(fā)展過程中較早期的分子事件。

本研究表明，頸段食管癌組織中DAPK基因啟動子區(qū)甲基化率很高（62.7%），而正常頸段食管部黏膜組織中無甲基化，說明頸段食管癌的發(fā)生可能與DAPK基因甲基化有關(guān)。統(tǒng)計分析顯示，DAPK基因甲基化與臨床病理分級和T分期無關(guān)，而與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。有研究顯示，肺癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移能力與DAPK水平有關(guān)，在肺癌細(xì)胞株中恢復(fù)DAPK的生理水平可抑制其轉(zhuǎn)移能力。Tang等［13］在研究非小細(xì)胞肺癌中甲基化與其愈后的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，DAPK基因過甲基化的腫瘤患者5年生存率（56%）比非甲基化的腫瘤患者（92%）明顯降低。同時他還發(fā)現(xiàn)當(dāng)用去甲基化藥物52aza2dc處理非小細(xì)胞肺癌時，這些細(xì)胞中的DAPK重新獲得表達(dá)和對腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的敏感性［14］。這些研究結(jié)果表明，DAPK有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的功能。檢測腫瘤組織中DAPK基因的甲基化，可為腫瘤預(yù)后分析提供理論依據(jù)。提示將脫甲基化藥物和死亡配體結(jié)合應(yīng)用將會提升抗癌效果。因此，作為一種重要的誘導(dǎo)凋亡作用的蛋白激酶，DAPK在癌癥治療中可作為一種潛在的藥物作用靶點(diǎn)［15］。

總之，以往研究已發(fā)現(xiàn)多種抑癌基因的啟動子區(qū)過甲基化與腫瘤發(fā)生有關(guān)，頸段食管癌中也發(fā)現(xiàn)了一些抑癌基因的甲基化，但DAPK基因啟動子區(qū)過甲基化與頸段食管癌發(fā)生的確切關(guān)系，還需進(jìn)一步研究。相信隨著研究的深入，抑癌基因啟動子區(qū)過甲基化將成為腫瘤診斷或預(yù)后估計的檢測指標(biāo)。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ Cohen O，Inbal B，Kissil JL，et al.DAP-kinase participates in TNF-α and Fas-induced apoptosis and its function requires the death domain.J Cell Biol，1999，146:141-148.

［2］ Baylin SB，Herman JG，Graff JR，et al.Alterations in DNA methylation:a fundamental aspect of neoplasia.Adv Cancer Res，1998，72:141-196.

［3］ Raveh T，Droguett G，Horwitz MS，et al.DAP kinase activates a p19ARF/p53-mediated apoptotic checkpoint to suppress oncogenic transfo-rmation.Nat Cell Biol，2001，3:1-7.

［4］ Jang CW，Chen CH，Chen CC，et al.TGF-beta induces apoptosis through Smad-mediated expression of DAP-kinase.Nat Cell Biol，2002，4:51-58.

［5］ Reddy AN，Jiang WW，Kim M，et al.Death associated protein kinase pr-omoter hypermethylation in normal human lymphocytes.Cancer Res，2003，63(22):7694-7698.

［6］ Widschwendter A，Muller HM，F(xiàn)iegl H，et al.DNA methylation in serum and tumors of cervical cancer patients.Clin Cancer Res，2004，10(2):565-571.

［7］ Roupret M，Hupertan V，Yates DR，et al.Molecular detection of lo-calized prostate cancer using quantitative methylation-specific PCR on urinary cells obtained following prostate massage.Clin Can-cer Res，2007，l3(6):1720-1725.

［8］ 何晶晶，毛易捷，許剛，等.前列腺癌組織中GSTP1和DAPK基因異常甲基化檢測及臨床意義.實用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25(9):1362-1364.

［9］ 胡禮炳，王國民，張利能，等.膀胱癌細(xì)胞中DAPK基因啟動子甲基化狀態(tài)分析.中華實驗外科雜志，2007，24(4):489-491.

［10］ 姜曉東，胡世蓮，孫玉蓓，等.胃癌中E-cadherin和DAPK基因啟動子異常甲基化的研究.中國腫瘤臨床，2009，36(7):383-387.

［11］ Jeong DH，Youm MY，Kim YN，et al.Promoter methylation of p16， DAPK，CDH1，TIMP23 genes in cervical cancer：correlation with clin-icopathologic characteristics.Int J Gynecol Cancer，2006，16(3):1234-1240.

［12］ Kuester D，Dar AA，Moskaluk CC，et al.Early involvement of deathassociated protein kinase promoter hypermethylation in the carc-inogenesis of Barretts esophageal adenocarcinoma and its associ-ation with clinical progression.Neop lasia，2007，9(3):236-245.

［13］ Tang X，Khuri FR，Lee JJ，et al.Hypermethylation of the deathassoc-iated protein (DAP) kinase promoter and aggressiveness in stage I non-small-cell lung cancer.J Natl Cancer Inst，2000，92:1511-1516.

［14］ Tang X，Wu W，Sun SY，et al.Hypermethylation of the death-associated protein kinase promoter attenuates the sensitivity to TRA IL induced apoptosis in human non-small cell lung cancer cells.Mol Cancer Res，2004，2(12):685-691.

［15］ Bialik S，Kimchi A.DAP kinase as a target for drug design in cancer and diseases associated with accelerated cell death.Sem in Cancer Biol，2004，14(4):283-294.