抗腫瘤的海洋微生物篩選

朱 蘭，何 偉，許書寧，周靜雯

(大連民族學院環境資源學院學生，遼寧大連 116605)

抗腫瘤的海洋微生物篩選

朱 蘭，何 偉，許書寧，周靜雯

(大連民族學院環境資源學院學生，遼寧大連 116605)

本研究利用人體宮頸癌細胞(Hela細胞)為靶細胞，在大連近海12種海洋動植物體內提取微生物。用4種分離培養基培養，分離并得到48株海洋微生物。對單菌落進行發酵，獲得其次生代謝產物。隨后，進行海洋微生物的發酵次生代謝產物的抗腫瘤鑒定［1－5］，研究結果發現，有1種菌株(12#－從黑泥中用MD培養基篩選的菌)發酵液對Hela細胞有較強的抑制作用，6種菌株發酵液有輕微的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

微生物分離培養材料取自大連近海的海泥、海水、魚類等12種樣品;腫瘤細胞為Hela細胞。

1.2 儀器及試劑

儀器:Vs—1300型潔凈工作臺、28℃RXZ—300B型培養箱、37℃MJ—180B型生化培養箱、MLS—3020高壓滅菌器、ZHWY－221B新型大容量全溫度恒溫培養震蕩器、動物細胞培養箱。

試劑:葡萄糖、海水、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、SDS、孟加拉紅、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸膏、可溶性淀粉、胎牛血清等。

1.3 方法

(1)在無菌操作臺上稱取2～4 g從海邊采集的樣品放入滅菌的小燒杯中，用無菌剪剪碎，無菌量筒稱取10倍的無菌海水，將樣品和海水一起倒入無菌三角瓶中，旋渦振蕩10 min，使其充分混懸制成懸濁液。取8 mL懸濁液于無菌離心管中，取2 次，離心振蕩 10 min，轉速為 1 500 r·min－1，離心后，取上清液備用。

(2)稀釋涂布平板法。將上述上清液與無菌陳海水按體積比1∶9 稀釋成10－3，10－4，10－5，10－6質量濃度，吸取10 μL，分別放入查氏培養基(Cha)、牛肉膏蛋白胨培養基(NRG)、高氏一號培養基(G1)、馬丁氏培養基(MD)(分別培養霉菌、細菌、放線菌、真菌)平板中，用無菌涂布器在培養基表面輕輕涂布，室溫下靜置30 min后置于30℃恒溫培養箱。待菌落長出后，觀察記錄菌落顏色、透明度、菌落表面、邊緣形態，檢查其特征是否一致。若發現有雜菌，需進一步分離，純化，直至獲得純菌落。

(3)菌種發酵。從斜面取活化培養的單菌落適量，分別接種到三角瓶中(每瓶30 mL發酵培養液)，于28℃振蕩搖床中 120 r·min－1振蕩培養10 d，發酵液備用測活。

(4)發酵產物抗腫瘤活性鑒定。將發酵液按照1∶50的體積比，即5 mL人體宮頸癌細胞培養液中放入100 μL的發酵液(不同時間取一個空白對照)再放入CO2培養箱中測活。抑制后從CO2培養箱中取出6孔板，用鑷子夾出玻璃片，放在擱物架上晾干，待完全干后進行染色。

(5)顯微觀察。在顯微鏡下觀察細胞形態特征以及數目，如細胞縮小，核質固縮聚集，形成小體及吞噬現象等。取附著有發酵培養液物質處的區域進行記數，用“+”表示抑制的強弱。

2 結果與討論

2.1 樣品測定的結果

篩選的單菌落對人體宮頸癌細胞(Hela細胞)的抑制結果見表1。

表1 單菌落對人體宮頸癌細胞(Hela細胞)的抑制結果

2.2 討論

從測定結果可以得出:48種單菌株發酵液中，有一種菌株對腫瘤細胞有較強的抑制作用，6種菌珠有輕微的抑制作用，其余菌珠對腫瘤細胞沒有抑制作用。

3 結語

綜上所述，海洋微生物是一個巨大的尚待開發的資源。海洋微生物數量大，種類多，隨著人類對海洋微生物認識的加深，對海洋微生物活性物質研究的深入，一定可以從中發現更多高效低毒的海洋微生物抗腫瘤新藥，使海洋微生物活性物質為人類做出更大貢獻。

［1］王正平，張慶林，胡艷紅.海洋微生物抗腫瘤活性物質的研究進展［J］.海洋科學，2002，26(8):28 －30.

［2］李越中，陳琦.海洋微生物資源及其產生生物活性代謝產物的研究［J］.生物工程進展，2000，20(5):28 －31.

［3］李利君，蔡慧農，蘇文金.海洋微生物生物活性物質的研究［J］.集美大學學報:自然科學版，2000，5(2):80－86.

［4］劉志鴻，程力，牟海津.海洋微生物活性物質的研究概況［J］.中國水產科學，1999，6(4):99－103.

［5］林永成，周世寧，樂長高.海洋微生物活性代謝產物化學［J］.大學化學，1996，11(6):5.

Q93－33

A

1009－315X(2011)05－0524－02

2011－06－20;最后

2011－07－04

指導教師:姜健(1970－)，男，內蒙古通遼人，教授，博士，主要從事細胞生物學研究;楊寶靈(1969－)，女，內蒙古通遼人，高級工程師，主要從事生物學研究。

(責任編輯 鄒永紅)