一株高產靈菌紅素粘質沙雷氏菌的篩選與鑒定*

韋 鳳， 蔣冬花， 蔡琪敏， 宋迤明

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

靈菌紅素是一類天然紅色素家族的總稱，是由多種放線菌和細菌產生的一類次級代謝產物．1929年Amako等在研究沙雷氏菌(Serratia)生長時發現，并由Harashima等在1960年首次分離得到此類物質［1-2］．隨后，對該類物質的性質及生物活性的研究一直倍受相關研究者的關注．隨著研究的不斷深入，它的許多生物學活性被人們所認識，包括抗細菌、抗瘧疾、抗真菌和抗原生動物的活性［3-5］．但人們最感興趣的是此物質所具有的免疫抑制活性和引起腫瘤細胞凋亡的作用［6-8］．

目前國內相關研究集中于靈菌紅素生產工藝的研究，著重于高產菌種的獲得和生產工藝的優化方面，以提高該天然色素的產量，降低生產成本［9-11］．

本研究通過篩選自然生境中產色素菌株，從淡水魚體中分離得到一株高產紅色色素的粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)，編號為 Sm-128菌株．通過紫外吸收光譜及薄層色譜實驗，結合前人的研究結果，證實其所產色素為靈菌紅素．用甘油培養基培養Sm-128菌株，靈菌紅素粗品產量可達475 mg/L．Sm-128菌株生長快、周期短，生長條件粗放，生產色素能力強，性狀穩定，可為工業化生產靈菌紅素提供優質的菌種資源．

1 材料與方法

1．1 菌株來源

高產靈菌紅素沙雷氏菌株分離自浙江金華水庫淡水魚體，編號為Sm-128，由本實驗室保藏．

1．2 培養基

1)PDA培養基:馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然 pH．

2)LB培養基:胰化蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7．0 ～7．2．

3)液體培養基(甘油蛋白胨培養基):蛋白胨5 g/L，甘油10 mL/L，自然 pH．

1．3 主要儀器與設備

紫外可見光分光光度計;旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);循環水式多用真空泵;精密pH計;電子分析天平;電熱恒溫水浴鍋;顯微鏡(Leica，德國)等．

1．4 菌種分離純化和篩選

選取不同生境的材料，以PDA培養基和LB培養基作為篩選培養基．從魚體等生境中篩選產生色素的菌株，方法(以魚體為例)如下:取浙江金華地區水庫淡水魚，取其內臟切碎，以無菌水浸泡2 h，采用濃度梯度稀釋法，選擇合適濃度(10－2，10－3)的樣液，取 200 μL 涂布于 PDA 培養基上，28℃恒溫培養，得紅色菌落．挑取紅色菌落，用連續劃線法純化，獲純菌株［12］128-130．

1．5 色素分析

1．5．1 紫外吸收光譜分析

通過測定色素分子對紫外/可見光的吸收，可以鑒定和定量分析大量的無機化合物和有機化合物．用藥匙從平板上刮取紅色菌苔，以無水乙醇作為浸提液，在研缽中充分研磨提取，收集融入色素的無水乙醇溶液，反復提取直到無水乙醇液不變色．將收集的無水乙醇溶液進一步離心，得上清液，在紫外分光光度計下測定并繪制上清液的吸收光譜圖［13］．

1．5．2 薄層色譜分析

薄層色析法(TLC)是高效的色譜分離和高靈敏度的檢出少量物質的一種實驗技術，也是判斷樣品純度的有效、簡單、快捷的方法．靈菌紅素提取常用的溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯及石油醚等，這些溶劑各具優缺點．結合文獻［14］，最終選定展開劑為:V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶1．根據色素在色譜板上的分離效果及Rf值，再結合文獻，判斷色素的性質．

1．5．3 產量分析

從活化的LB培養基上挑取約2環菌種接入培養液中，28℃，150 r/min培養12 h，再以3%的接種量接入發酵培養液中，在28℃，150 r/min培養24 h，可得含靈菌紅素的菌體，并有少量目的產物在培養液中．

發酵液以10 000 r/min離心15 min，并重復洗滌3次后得菌體和培養液．菌體直接用無水乙醇作為浸提液，輔以超聲波破碎進行色素浸提，離心得上清液，反復多次直至菌體無顏色．收集上清液，經旋轉蒸發儀濃縮，得色素粗品，稱量，計算產量．

1．6 菌種鑒定

1．6．1 形態觀察

純化后的菌株分別接種于PDA培養基、LB培養基中，28℃培養2 d，取菌體先用簡單染色法和革蘭氏染色法染色，再用顯微鏡觀察拍照．

1．6．2 生理生化特征分析

菌株用LB培養基28℃培養連續觀察5 d，進行糖發酵、氧化酶、觸酶、尿素酶和H2S、甲基紅等實驗［12］220-225．

1．6．3 16S rDNA 基因序列分析

菌株基因組DNA的提取參照文獻［15］的方法．利用細菌的16S rDNA通用正反向引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，以基因組 DNA為模板進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增．PCR程序為:98℃5 min，95 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min 30 s，35個循環，延伸8 min．PCR擴增用Taq酶，產物連入克隆載體pUCm-T后，由上海生物工程技術公司完成測序．

1．6．4 同源性分析及系統發育樹的構建

利用BLAST程序尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種，然后從GenBank基因序列數據庫中提取近緣菌株的16S rDNA基因序列，與測定的序列共同用Clustal X程序校準排齊進行多序列比較后，用MEGA4軟件以鄰接法(Neighbor-Joining法)構建系統發育樹．

2 結果與分析

2．1 產色素菌株的分離、純化和初篩

從自然界不同生境中篩選產色素的菌株，經分離、純化，共獲得16株產不同色素的菌株．其中:產紅色色素的菌株9株(見圖1(a)，(c)和(f));產黃色色素的菌株4株(見圖1(b)和(e));產粉色色素的菌株2株(見圖1(d));產紫色色素的菌株1株．根據傳統分類方法觀察菌落、菌體特征，16株菌株中包括8株細菌、3株放線菌和5株真菌．部分菌株的菌落如圖1所示．

圖1 部分產色素菌株的菌落

2．2 產靈菌紅素菌株的復篩

靈菌紅素為一類紅色天然色素．從初篩結果可以看出，篩選出的16株產色素菌株中有9株產紅色色素，故對這9株菌株進行復篩．靈菌紅素紫外光譜吸收峰在535 nm處［14］，采用紫外吸收光譜法對9株菌株所產色素進行掃描檢測，最終獲得1株符合靈菌紅素吸收光譜(見圖2(a))的菌株．該菌株分離篩選自浙江金華淡水魚體，編號為Sm-128．

2．3 Sm-128菌株產色素的分析

2．3．1 紫外吸收光譜分析

Sm-128菌株產色素的紫外可見光吸收光譜見圖2(a)．以無水乙醇作為浸提液所得色素在535 nm處有明顯的吸收峰，說明該色素的分子結構具有很大的共軛體系，可能有很多共軛雙鍵、苯環或類似苯環的共軛結構，或含雜原子的雜環．從相關資料已知靈菌紅素的最大吸收波長為535 nm，其分子結構中含有3個吡咯環［13］．Sm-128菌株所產色素的紫外可見光吸收光譜圖與文獻報道的靈菌紅素的紫外吸收譜圖一致．

2．3．2 薄層色譜分析

圖2 Sm-128菌株產色素(無水乙醇浸提)的分析

實驗結果表明，所選展開系統(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=1∶1)對Sm-128菌株所產色素有較好的分離效果．在此展開系統下得到一紅色清晰斑點，其比移值Rf=0．60(見圖2(b))，與文獻報道靈菌紅素的結果一致．紫外吸收光譜及薄層色譜分析結果均與已有文獻［14］的結果一致，故可判斷該菌株所產色素即為靈菌紅素．

2．3．3 色素產量測定

Sm-128菌株生長迅速，生長條件粗放，在甘油培養基上經過種子擴大培養發酵3 d后，培養液色澤鮮艷，菌體粘稠．采用上述分離提取方法測得菌體生物量為3 g/L，色素產量達475 mg/L．

2．4 Sm-128菌株的鑒定

2．4．1 形態特征

Sm-128菌株在LB培養基上呈紅色，隨培養時間的延長顏色逐漸加深，生長迅速，12 h后菌落為圓型，表面隆起，光滑粘稠，易挑取(見圖3(a))，有輕微異味．在不同的培養基上，其生長狀態、顏色有所差異．

Sm-128菌株在顯微鏡下觀察為球形或短桿狀，長度1．0 ～1．2μm，寬度0．9 ～1．0 μm，革蘭氏染色陰性，無芽孢，無運動(見圖3(b))．

圖3 Sm-128菌株的形態特征

2．4．2 生理生化特征

Sm-128菌株革蘭氏染色呈陰性，兼性好氧;二乙酰試驗(V-P試驗)和過氧化氫酶反應陽性，甲基紅(MR)試驗、氧化酶和苯丙氨酸反應陰性;能利用蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露醇和阿拉伯糖產酸，不能利用乳糖產酸;能還原硝酸鹽;利用檸檬酸鹽可使明膠水解;不能在三糖鐵(TSI)瓊脂實驗中產生H2S．

2．4．3 分子生物學鑒定及其系統發育樹

Sm-128菌株基因組DNA提取結果見圖4．采用細菌的16S rDNA通用引物進行PCR擴增，獲得長度為1 503 bp的基因，序列測定委托上海生物工程技術公司完成．該基因序列已在GenBank注冊(HQ834310)．

將Sm-128菌株的16S rDNA基因序列用BLAST進行相似性比較后發現，其與沙雷氏菌屬內種的同源性最高．然后，將Sm-128菌株的16S rDNA基因序列與GenBank數據庫中已知的沙雷氏菌屬內近緣菌株進行多序列比較后，用MEGA4以Neighbor-Joining法繪制系統發育樹(見圖5)，與粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)菌株的同源性達99．2%．結合形態特征和生理生化特征最終鑒定該Sm-128菌株屬于沙雷氏菌屬(Serratia)的粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)．

圖4 Sm-128菌株基因組DNA和16S rDNA電泳分析圖

圖5 基于16S rDNA基因序列建立的沙雷氏菌屬系統發育樹

3 結論與討論

在從自然界不同生境中篩選產色素菌株的過程中獲得了16株顏色各異、具有代表性的微生物菌株，其中包含1株在淡水魚體內分離得到的產紅色色素、生長迅速、條件粗放的Sm-128菌株．

本實驗對Sm-128菌株首先通過常規的菌落外觀特征、顯微鏡下特征和生理生化實驗［16］進行了初步鑒定，進一步通過16S rDNA序列分析得到其與粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)同源性為99．2%，最終鑒定該菌為粘質沙雷氏菌．該菌株的16S rDNA基因序列已在GenBank注冊(HQ834310)．

粘質沙雷氏菌是生產靈菌紅素的主要菌株，本實驗所述Sm-128菌株所產色素表觀可見為紅色色素，紫外吸收光譜和薄層色譜分析所得結論均與已有文獻結論相一致，故判斷Sm-128菌株所產色素即為靈菌紅素．該菌株在甘油培養基上培養的生物量可達3 g/L，色素粗品產量達475 mg/L．此產量為未經過條件優化的結果，且提取工藝尚待進一步優化．

靈菌紅素是一大類紅色色素的總稱，該實驗中目前所得結果尚未精確到色素的具體組分，將通過后續實驗分析其不同的組分與結構．

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