氧化還原因子-1的原核表達純化及其活性鑒定*

丁正中， 張 璐， 李 濤

(1．浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004;2．艾青中學，浙江金華 321015)

氧化還原因子-1(Ref-1)是哺乳動物細胞中重要的雙功能蛋白，在DNA損傷修復及抗氧化防御屏障中發揮著關鍵作用．Ref-1由318個氨基酸殘基構成，分子量約為37 kD，包含2個主要功能域．Ref-1的C端功能區進化高度保守，約157個氨基酸，具有核酸內切酶活性．離子輻射、活性氧(radical oxygen substrates，ROS)和烷化劑等可引起DNA損傷，造成脫嘌呤/脫嘧啶位點(apurinic/apyrimidinic sites，AP 位點)．Ref-1是 AP 位點堿基切除修復(base excision repair，BER)途徑中主要的限速酶［1］．如果Ref-1的這一功能缺陷，將造成AP位點累積，誘導細胞凋亡．放射治療、烷化劑及核苷酸類似物藥物(如:博萊霉素、替莫唑胺、吉西他濱等)均可顯著增強Ref-1蛋白表達，是腫瘤細胞產生獲得性耐藥，最終導致藥物失敏的重要機制［2-4］．

Ref-1獨特的親水性N末端由約127個氨基酸組成，種屬差異較大，該段序列賦予Ref-1氧化還原酶活性．氧化損傷造成半胱氨酸巰基發生二硫鍵交聯、S-硝基化、谷胱甘肽化．通過還原半胱氨酸殘基，Ref-1能回復氧化損傷蛋白的功能活性．Ref-1能顯著促進許多轉錄因子的激活并提高它們的DNA結合能力，這代表了信號轉導中一種新型的氧化還原調控模式，對真核基因表達意義重大［5］．氧化應激條件下，Ref-1表達增高或磷酸化活化，引起參與氧化還原調節的激活蛋白-1(AP-1)等轉錄因子活性變化，進而引起下游靶基因的活化，使一些對細胞具有保護作用的蛋白得到表達．因此，抑制Ref-1氧化還原酶活性，亦能促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤增殖．

Ref-1的高表達、活性增高及亞細胞定位改變與多種腫瘤的發生有關，并關系到腫瘤的惡性程度以及放化療的敏感性［6-8］．如何抑制Ref-1的表達或活性，是目前腫瘤靶向治療的重要課題．本實驗通過原核表達純化人源Ref-1蛋白，建立了其活性檢測體系，為進一步研究Ref-1蛋白的功能、篩選Ref-1特異性抑制劑建立前期基礎．

1 材料與方法

1．1 材料

菌株BL21(DE3)和質粒pGEX-4T-3為浙江師范大學動物生理實驗室保存．pRc/RSV-Ref-1質粒由日本名古屋大學Fukushi Kambe教授惠贈．

1．2 原核表達載體的構建

HindⅢ和XbaⅠ雙酶切將Ref-1編碼片段從pRC/RSV真核表達載體中釋放出來，插入pBluesciptⅡ SK(+)相應位點．pBluesciptⅡSK(+)/Ref-1質粒經SalⅠ和NotⅠ雙酶切釋放Ref-1編碼片段，插入pGEX-4T-3相應位點，完成Ref-1原核表達載體的構建．挑取單克隆進行酶切鑒定，并由北京奧科公司測序，確定基因正確插入且無突變．

1．3 GST-Ref-1融合蛋白的表達

重組質粒轉化感受態細菌BL21，挑克隆，在含氨芐西林(Amp)的LB培養基上搖菌過夜．將50 mL培養液擴大培養至1 000 mL LB培養液中220 r/min培養2～4 h，使 A600=0．6，降低溫度至30℃，加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0．4 mmol/L，搖菌4～6 h．收集菌液，每1 000 mL細菌用40 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，冰上超聲直至液體不再混濁，4℃，14 000 r/min離心20 min，收集上清液．分別取誘導前后的培養液及超聲離心后的上清液和沉淀，加入2×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，煮沸后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，分析融合蛋白的表達情況．

1．4 GST-Ref-1融合蛋白的純化

加1 mL 50%谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B(Glutathione Sepharose 4B)溶液至超聲后的上清液中，室溫下垂直混懸器混懸結合過夜，4℃，500 r/min離心5 min后，收集珠子，預冷的1 mL磷酸鹽緩沖液洗5遍，離心后收集珠子，加1 mL 10 mmol/L還原型谷胱甘肽洗脫緩沖液，垂直混懸器輕輕混懸20 min，4 ℃，500 r/min離心5 min，吸出上清液置新管中．再重復洗滌3次，分別收集上清液．

將上清液收集入透析袋，4℃透析3次，每4 h更換透析液(PBS)，聚乙二醇8000(PEG8000)濃縮至1 mL，加入終含量為10%的甘油，含0．5 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)，－80℃保存．純化后的蛋白進行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍染色檢測條帶．谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)按上述方法表達純化．

1．5 蛋白質印跡(Western blot)

分別取10 μL純化的GST-Ref-1及GST進行SDS-PAGE分析，濕式電轉化轉膜．以兔源Ref-1抗體為一抗，辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔抗體為二抗，用電化學發光(ECL)顯色試劑盒顯影曝光，鑒定表達產物．

1．6 GST-Ref-1氧化還原酶活性的檢測

應用凝膠阻滯法檢測GST-Ref-1氧化還原酶活性．按文獻方法提取HeLa細胞核蛋白，建立體外反應體系［9-10］．北京奧科公司合成轉錄因子AP-1特異識別的雙鏈探針，正鏈序列為5'-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3'．T4多聚核苷酸激酶對探針進行末端32P標記．在每組反應混合物中，核蛋白用量為40 μg，GST-Ref-1的用量是400 ng．核蛋白與GST-Ref-1體外混勻后，用終濃度為20 mmol/L的H2O24℃處理15 min后，用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影顯示AP-1蛋白與探針DNA結合條帶．

2 結果與分析

圖1 質粒酶切鑒定圖

2．1 Ref-1原核表達載體的構建及鑒定

Ref-1原核表達載體的構建流程如下:首先，用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切將Ref-1編碼片段從測序正確的pRC/RSV真核表達載體中釋放出來，之后將Ref-1編碼片段插入pBluesciptⅡ SK(+)相應位點，經鑒定2－4泳道的克隆均為正確插入目的基因的重組質粒(見圖 1(a));接著，用SalⅠ和NotⅠ雙酶切釋放約1 kb的Ref-1編碼片段，插入pGEX-4T-3相應位點，從而完成GSTRef-1原核表達載體的構建，經鑒定8泳道的克隆為目的重組質粒(見圖1(b))．圖1中酶切出現1 kb左右的條帶，說明獲得了Ref-1編碼片段．測序結果表明，pGEX-4T-3/Ref-1質粒構建正確，讀碼框無移碼，無堿基錯配．

2．2 GST-Ref-1融合蛋白的原核誘導表達

將pGEX-4T-3/Ref-1質粒轉入BL21(DE3)菌株，IPTG誘導表達外源基因．為了能夠檢測融合蛋白的表達效率及其可溶性，分別取誘導前后的菌體及裂菌后的上清液、沉淀，同時進行SDSPAGE，對凝膠進行考馬斯亮藍染色，分析蛋白條帶．如圖2所示，GST-Ref-1蛋白得到了有效的表達，2號孔為誘導后蛋白電泳條帶，在65 kD左右出現明顯的誘導條帶，符合理論預期．并且，GSTRef-1蛋白的表達性質基本為可溶性表達，3號孔為上清液樣品，可發現其中含有大量的GST-Ref-1融合蛋白．這些證據表明GST-Ref-1原核表達成功，并且基本為可溶性表達，極有利于下一步的純化操作及后續研究．

圖2 GST-Ref-1融合蛋白誘導表達圖

2．3 GST-Ref-1融合蛋白的親和純化

采用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B珠子親和富集GST-Ref-1融合蛋白，再用10 mmol/L還原型谷胱甘肽洗脫GST-Ref-1融合蛋白，分別流洗4次，每個批次的洗脫液取10 μL做SDS-PAGE染色，如圖3所示，GST-Ref-1融合蛋白得到了有效的親和純化，并以第2次流洗的效率最高．Science lab軟件灰度掃描，得出純化蛋白的純度為92%．對純化的GST-Ref-1融合蛋白進行透析去除谷胱甘肽，PEG8000濃縮后加甘油凍存于－80℃冰箱中．

圖3 GST-Ref-1融合蛋白親和純化后產物的電泳圖

為了計算融合蛋白的誘導效率及親和純化的蛋白得率，實驗中對每次保留的蛋白都進行了BCA法蛋白定量．首先通過Science lab軟件灰度掃描分析，得出誘導后GST-Ref-1融合蛋白占菌體蛋白的比率為21．5%．再經BCA法蛋白定量，得出經親和純化濃縮后的GST-Ref-1融合蛋白占誘導后原始菌體的比率為6．8%，占超聲裂解后上清液中蛋白的比率為11．7%．

2．4 蛋白質印跡(Western blot)檢測

蛋白質印跡檢測驗證GST融合蛋白是否為表達序列正確的Ref-1蛋白．如圖4所示，只有GST-Ref-1條帶位置能檢測到強化學發光信號，而對照GST條帶無發光信號．表明GST-Ref-1原核表達質粒能夠正確表達Ref-1融合蛋白，具有良好的抗原性．

圖4 GST-Ref-1融合蛋白純化終產物PAGE考馬斯亮藍染色及蛋白質印跡檢測

2．5 GST-Ref-1蛋白活性的檢測

許多轉錄因子受到Ref-1氧化還原調控，如AP-1，NFκB，CREB，ATF，NF-Y 和 p53 等，Ref-1 能直接增強轉錄因子的DNA結合能力．為了驗證GST-Ref-1融合蛋白是否具備活性，通過凝膠阻滯實驗對其氧化還原酶活性進行了檢測．結果如圖5所示:GST-Ref-1直接增強了AP-1與靶DNA的結合量，而GST蛋白本身對AP-1的DNA結合能力無影響，表明GST-Ref-1融合蛋白能增強AP-1的DNA結合能力;同時，H2O2抑制了AP-1與探針的結合，但同時加入GST-Ref-1蛋白能部分恢復AP-1的DNA結合活性．表明GST-Ref-1融合蛋白具有氧化酶活性．

圖5 凝膠阻滯法檢測GST-Ref-1融合蛋白氧化還原酶活性

3 討論

本實驗采用pGEX-4T-3載體系統，通過IPTG誘導表達，獲得了GST-Ref-1融合蛋白的可溶性表達，并進行了親和純化，蛋白在菌體中未出現明顯的降解．該系統有利于GST-Ref-1融合蛋白的可溶性表達與親和純化，純化條件溫和、步驟簡單，同時能極大限度地保持融合蛋白的空間結構和免疫原性，有利于下一步實驗操作．本實驗所獲得的GST-Ref-1融合蛋白，可用于抗體制備，利用GST pull-down實驗揭示 Ref-1互作蛋白，篩選Ref-1蛋白抑制劑．

Ref-1是重要的抗氧化基因，亦是重要的腫瘤耐藥基因．Ref-1具有AP內切酶活性，可修復放射、烷化劑、氧化應激造成的DNA損傷;同時其所具有的氧化還原酶活性能調控大量轉錄因子的活性，上調 Bcl-2等抗凋亡基因的表達．Robertson等［11］首先發現，在宮頸癌、睪丸癌中Ref-1過表達可增強其對博來霉素和射線的抵抗．Fishel等［12］研究發現，Ref-1在卵巢腫瘤中高表達，如利用siRNA技術將其沉默掉，腫瘤體積明顯縮小，細胞增殖減慢，阻滯于細胞周期S期．王東研究組［13］構建了Ref-1的RNAi質粒，轉染骨肉瘤細胞系9901，發現抑制Ref-1表達能夠下調血管來源的生長因子(VEGF)表達，抑制腫瘤微血管的形成，同時提高了骨肉瘤細胞放療的敏感性．Ref-1還能誘導腫瘤細胞的多藥耐藥性．近期研究發現，Ref-1調控轉錄因子 YB-1，從而誘導多藥耐藥基因MDR1的表達［14］．MDR1基因編碼跨膜蛋白 P-糖蛋白，P-糖蛋白為藥物泵，通過三磷酸腺苷(ATP)提供能量，可將藥物泵出細胞外，使其細胞毒作用減弱直至喪失，出現耐藥現象．因此，Ref-1是腫瘤治療的重要靶向分子．

研究者開發了多種藥物試圖封閉Ref-1的表達或活性［15-17］．第1類為AP內切酶活性抑制劑，主要有7-硝基吲哚-2-甲酸、CRT0044876、硫蒽酮和甲氧胺;第2類為氧化還原酶活性抑制劑，如E3330和白藜蘆醇，此類抑制劑往往同時抑制活性氧通路及NFκB的活化，效應相對較廣;第3類則是能夠抑制Ref-1表達的化學物質，如大豆異黃酮．

本實驗表達的GST-Ref-1融合蛋白，經體外凝膠阻滯實驗發現具有氧化酶活性，能直接增強AP-1的DNA結合能力，并能抑制H2O2對AP-1蛋白的損傷．如何構建合適的藥物篩選體系，檢驗藥物對Ref-1 AP內切酶及氧化還原酶活性的影響，將是一個有意義的研究方向．

［1］Fishel M L，Kelley M R．The DNA base excision repair protein Ape1/Ref-1 as a therapeutic and chemopreventive target［J］．Mol Aspects Med，2007，28(3/4):375-395．

［2］Bobola M S，Finn L S，Ellenbogen R G，et al．Apurinic/apyrimidinic endonuclease activity is associated with response to radiation and chemotherapy in medulloblastoma and primitive neuroectodermal tumors［J］．Clin Cancer Res，2005，11(20):7405-7414．

［3］Zhang Ying，Wang Jian，Xiang Debing，et al．Alterations in the expression of the apurinic/apyrimidinic endonuclease-1/redox factor-1(APE1/Ref-1)in human ovarian cancer and indentification of the therapeutic potential of APE1/Ref-1 inhibitor［J］．Int J Oncol，2009，35(5):1069-1079．

［4］熊光蘇，吳叔明，徐曉晶，等．吉西他濱對人胰腺癌Patu-8988細胞株APE/Ref-1的誘導作用［J］．世界華人消化雜志，2007，15(12):1425-1428．

［5］Bhakat K K，Mantha A K，Mitra S．Transcriptional regulatory functions of mammalian AP-endonuclease(APE1/Ref-1)，an essential multifunctional protein［J］．Antioxid Redox Signal，2009，11(3):621-638．

［6］Jiang Y，Zhou S，Sandusky G E，et al．Reduced expression of DNA repair and redox signaling protein APE1/Ref-1 impairs human pancreatic cancer cell survival，proliferation，and cell cycle progression［J］．Cancer Invest，2010，28(9):885-895．

［7］Wang Dong，Luo Meihua，Kelley M R．Human apurinic endonuclease 1(APE1)expression and prognostic significance in osteosarcoma:enhanced sensitivity of osteosarcoma to DNA damaging agents using silencing RNA APE1 expression inhibition［J］．Mol Cancer Ther，2004，3(6):679-686．

［8］陳連生，王東，張云嵩，等．DNA損傷修復基因APE1表達與非小細胞肺癌術后治療及預后關系的研究［J］．重慶醫學，2007，36(19):1915-1917．

［9］Merluzzi S，Moretti M，Altamura S，et al．CD40 stimulation induces Pax5/B SAP and EBF activation through a APE/Ref-1-dependent redox mechanism［J］．J Biol Chem，2004，279(3):1777-1786．

［10］耿燕，李濤，胡曉青，等．氧化還原因子1促進乳鼠心肌成纖維細胞增殖［J］．北京大學學報:醫學版，2009，41(3):335-342．

［11］Robertson K A，Bullock H A，Xu Y，et al．Altered expression of Ape1/ref-1 in germ cell tumors and overexpression in NT2 cells confers resistance to bleomycin and radiation［J］．Cancer Res，2001，61(5):2220-2225．

［12］Fishel M L，He Y，Reed A M，et al．Knockdown of the DNA repair and redox signaling protein Ape1/Ref-1 blocks ovarian cancer cell and tumor growth［J］．DNA Repair，2008，7(2):177-186．

［13］Wang Dong，Zhong Zhaoyang，Li Mengxia，et al．Vector-based Ape1 small interfering RNA enhances the sensitivity of human osteosarcoma cells to endostatin in vivo［J］．Cancer Sci，2007，98(12):1993-2001．

［14］Chattopadhyay R，Das S，Maiti A K，et al．Regulatory role of human AP-endonuclease(APE1/Ref-1)in YB-1-mediated activation of the multidrug resistance gene MDR1［J］．Mol Cell Biol，2008，28(23):7066-7080．

［15］Bapat A，Fishel M L，Kelley M R．Going ape as an approach to cancer therapeutics［J］．Antioxid Redox Signal，2009，11(3):651-668．

［16］Reed A M，Fishel M L，Kelley M R．Small-molecule inhibitors of proteins involved in base excision repair potentiate the anti-tumorigenic effect of existing chemotherapeutics and irradiation［J］．Future Oncol，2009，5(5):713-726．

［17］Luo M，Delaplane S，Jiang A，et al．Role of the multifunctional DNA repair and redox signaling protein Ape1/Ref-1 in cancer and endothelial cells:small-molecule inhibition of the redox function of Ape1［J］．Antioxid Redox Signal，2008，10(11):1853-1867．