佛手炭疽病病原菌的生物學特性研究*

路 梅， 楊佳妮， 周端頊， 李永強

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

佛手(Citrus medica L．var．sarcodactylis)又名五指橘，為蕓香科常綠灌木或小喬木，果實張開如手指狀，故名佛手．主產于閩粵、川、江浙等省，其中以浙江金華佛手最為著名，被譽為“果中之仙品，世上之奇卉”，雅稱“金佛手”，具有很高的觀賞和藥用價值．

佛手的主要病害有潰瘍病、煤煙病和炭疽病．炭疽菌屬(Colletotrichum)是一類重要的植物病原真菌，能引起葉斑、果腐、嫩梢或枝條回枯等癥狀，嚴重危害多種經濟農作物等，造成較大的經濟損失．2009年，浙江師范大學分子生物學實驗室從金華市錦林佛手有限公司佛手炭疽病病樣中分離得到一株病原真菌，經常規(guī)形態(tài)學和分子rDNAITS(內轉錄間隔區(qū))鑒定，確定為膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)．本文主要對該病原菌的生物學特性進行了研究．

1 材料與方法

1．1 實驗材料

從金華市錦林佛手公司基地采集佛手炭疽病病樣，在浙江師范大學分子生物學實驗室，采用單孢分離法進行病原菌分離純化，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，4℃保存．

1．2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基;胡蘿卜培養(yǎng)基(CA);燕麥培養(yǎng)基(OA);玉米粉培養(yǎng)基(CMA);查氏(Czapek)培養(yǎng)基(CZ)．配方見文獻［1］．

1．3 實驗方法

接種菌種于PDA培養(yǎng)基中，于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，用滅菌打孔器打取菌落邊緣，打取直徑5 mm的菌餅，用于以下實驗．

1．3．1 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

分別接種菌餅于 PDA，CA，OA，CMA，CZ 和水瓊脂平板中央，且菌絲面朝下放置，25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(下同)．每天用十字交叉法測量菌落直徑，每處理 5 次重復［2］(下同)．

1．3．2 溫度對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

接種菌餅至PDA培養(yǎng)基中央，分別在5，10，20，25，28，35 和 40 ℃的恒溫條件下培養(yǎng) 5 d，觀察菌絲生長情況，每天測量菌落直徑．將PDA平板上培養(yǎng)7 d產生的分生孢子用無菌水洗下，配制成低倍鏡下每視野20～30個孢子的懸浮液(下同)．將孢子懸浮液滴于凹玻片上，分別置于5～40℃的 7種溫度下保濕培養(yǎng)［3］，并于 6，14和24 h后取出，觀察孢子萌發(fā)情況，計算孢子萌發(fā)率．

1．3．3 pH對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液調節(jié)滅菌后未凝固PDA培養(yǎng)基的pH，制成pH值分別為3，4，5，6，7，8，9，10 和 11 共 9 種培養(yǎng)基，制平板后，接種菌餅至平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)．連續(xù)5 d測量菌落直徑，求其平均菌落直徑．

用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液配制 pH 值分別為 3，4，5，6，7，8，9，10 和 11 的9種緩沖溶液，用于配制孢子懸浮液，滴于凹玻片上，28℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)6，14和24 h后，鏡檢并統計孢子萌發(fā)率．

1．3．4 光照對菌絲生長的影響

設置連續(xù)光照、12 h明暗交替和完全黑暗3種光照條件，菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5 d后，測量菌落直徑．

1．3．5 致死溫度的測定

取在PDA平板上已活化培養(yǎng)5 d的病原菌，先加入少量無菌水至培養(yǎng)基上，用滅菌三角玻璃棒刮取菌絲體，然后用滅菌雙層紗布過濾菌液，濾液為菌絲和分生孢子混合懸浮液．取滅菌具塞玻璃試管，分別置于 40，45，50，55，60 和 65 ℃ 恒溫水浴鍋中，當試管內溫度達到設定溫度時，加入2 mL病原菌懸浮液，水浴10 min，一支試管在室溫中放置作為對照．各取0．2 mL經過處理的病原菌懸浮液，涂在PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，48 h后觀察有無菌落出現．

1．3．6 葡萄糖對孢子萌發(fā)的影響

刮取PDA培養(yǎng)基上病原菌分生孢子，分別放入有 0．1%，0．5%，1%，2%，3%，4% 和 5% 葡萄糖溶液的凹玻片上，輕輕攪動，形成孢子懸浮液．將凹玻片放入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于黑暗條件下28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．在顯微鏡下觀察和統計不同時間孢子的萌發(fā)率．

1．4 數據分析

采用DPS V7．05數據分析軟件進行Duncan氏新復極差法檢驗;EXCEL 2003進行數據處理和圖表制作．

2 結果與分析

2．1 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

從表1可知，除水瓊脂培養(yǎng)基外，佛手炭疽病病原菌在其余5種培養(yǎng)基上都能生長．在PDA培養(yǎng)基上生長最好，氣生菌絲豐富，產孢較多;在CA，OA和CMA培養(yǎng)基上次之;在CZ培養(yǎng)基上生長較差，菌落生長速度慢，氣生菌絲較少．說明該病原菌適宜在半合成培養(yǎng)基上生長．水瓊脂培養(yǎng)基只含有微量的營養(yǎng)和礦物質，不能滿足病原真菌的生長需求．

表1 培養(yǎng)基對佛手炭疽病病原菌菌絲生長的影響

2．2 溫度對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

溫度對佛手炭疽病病原真菌菌絲生長的影響較大(見表2)．培養(yǎng)溫度在5～40℃時，菌絲均可生長;在5～28℃時，菌絲的生長速率隨著溫度的升高而加快，至28℃時菌絲生長速度最快，培養(yǎng)5 d平均菌落直徑達5．95 cm;28℃以上，菌絲生長速率逐漸降低．在5和40℃下培養(yǎng)5 d，菌落直徑分別為1．03和1．29 cm，有少量菌絲萌發(fā)，菌絲生長勢很差．因此，該病原菌菌絲生長的最佳溫度范圍為25～28℃，最適溫度為28℃．

表2 溫度對佛手炭疽病病原菌菌絲生長的影響

圖1 溫度對佛手炭疽病病原菌孢子萌發(fā)的影響

圖1 顯示了不同培養(yǎng)溫度對佛手炭疽病病原菌孢子萌發(fā)的影響．在5～40℃，其孢子均可萌發(fā)，且隨著培養(yǎng)時間的延長，萌發(fā)率升高．但是，與溫度對菌絲生長的影響不同，孢子萌發(fā)的最適溫度為20℃．在20℃下，孢子培養(yǎng)14 h的萌發(fā)率遠遠高于培養(yǎng)6 h和24 h的萌發(fā)率．

2．3 pH對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

不同酸堿度的PDA培養(yǎng)基對佛手炭疽病病原菌菌絲生長的影響見圖2．病原真菌在pH 3～11的培養(yǎng)基上均能生長，在pH 4～9生長較好，最適生長pH值為7，培養(yǎng)5 d平均生長速率為6．40 cm/d．

圖2 pH對佛手炭疽病病原菌菌絲生長的影響

圖3 pH對佛手炭疽病病原菌孢子萌發(fā)率的影響

圖3 顯示培養(yǎng)基pH對佛手炭疽病病原菌孢子萌發(fā)率的影響顯著．由圖3可知:分生孢子在pH 2～11培養(yǎng)12～48 h都能產孢;而且在一定的酸堿度條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，孢子萌發(fā)率升高．但是，孢子萌發(fā)率隨pH的變化而變化．在pH 6～9時，孢子萌發(fā)率較高;在 pH 8時培養(yǎng)48 h，孢子萌發(fā)率最高，為52．7%;當 pH值為1和12時，孢子均不能萌發(fā)．

2．4 光照對菌絲生長的影響

佛手炭疽病病原菌在不同的光照條件下生長速率不同．在培養(yǎng)5 d后，菌落生長速率大小為黑暗條件＞持續(xù)光照＞半光半暗(見圖4)，生長速率最快為 1．29 cm/d．

圖4 光照對佛手炭疽病病原菌菌絲生長的影響

2．5 致死溫度的測定

佛手炭疽病病原菌懸浮液經40～60℃水浴處理10 min后，部分菌絲仍能正常生長;65℃以上溫度處理后，菌絲完全停止生長，說明病原菌的致死溫度為65℃．

2．6 葡萄糖對孢子萌發(fā)率的影響

不同含量的葡萄糖溶液中佛手炭疽病病原菌孢子萌發(fā)實驗顯示(見圖5):在相同的培養(yǎng)時間內，孢子萌發(fā)率基本隨著葡萄糖含量的加大而降低;在相同含量的葡萄糖溶液中，孢子萌發(fā)率則隨著培養(yǎng)時間的延長而加大．不同含量的葡萄糖處理對孢子萌發(fā)率的影響差異顯著．培養(yǎng)36 h后，孢子萌發(fā)率在葡萄糖含量較低與較高之間的差異趨于減小．實驗結果說明葡萄糖能夠促進其分生孢子的萌發(fā)．在葡萄糖質量分數為0．1%，培養(yǎng)48 h時，孢子的萌發(fā)率最高．

圖5 葡萄糖含量對佛手炭疽病病原菌孢子萌發(fā)的影響

3 討論

佛手是金華地區(qū)的一種傳統經濟植物，已有700多年的栽培歷史．據金華市相關部門統計，2006年佛手最高畝產純利潤可達20余萬元．近年，國內外對佛手的研究多集中于佛手的栽培［4］、化學成分的提取和分析［5］、轉基因研究［6-9］等方面，對佛手病原菌的研究甚少．本文對佛手炭疽病病原菌的生物學特性進行了首次研究報道．

微生物的生長需要一定的營養(yǎng)條件．不同的培養(yǎng)基對菌絲生長影響的研究發(fā)現，佛手炭疽病病原真菌在半合成培養(yǎng)基(PDA)上生長速率最快，在合成培養(yǎng)基(CZ)上則生長勢較差．這與謝丙炎等［10］對辣椒炭疽病菌(C．capsici)的研究結果一致．賀春萍等［11］對紅毛丹炭疽病菌(C．gloeosporioides)的研究卻認為，病原菌無論是在PDA還是CZ培養(yǎng)基上生長勢都較好．Estrada等［12］報道芒果炭疽病菌(C．gloeosporioides)的最適生長溫度為28℃，致死溫度為65℃ 10 min，與本文的研究結果一致．佛手炭疽病病原真菌在pH 3～11均可生長，中性偏酸條件下菌絲生長較快，pH值為7時生長最好，符合真菌對酸度的適應范圍廣并偏好略帶酸性環(huán)境的特性［1］．真菌孢子的萌發(fā)受內在因子和環(huán)境條件的影響．佛手炭疽病菌的孢子萌發(fā)最適溫度為20℃，孢子萌發(fā)最適pH值為6～9，與其他關于膠胞炭疽菌的相關報道［10-12］不同．

炭疽菌屬是一類十分重要的植物病原真菌，在熱帶、亞熱帶地區(qū)危害嚴重，給農業(yè)生產帶來巨大的損失．本文研究結果表明，佛手炭疽病病原真菌和其他不同來源的炭疽病病原真菌的生物學特性存在一定的差異，這可能與菌株的變異有關，需要進一步的研究證實．此外，該病原真菌對酸堿和高溫的適應性很強，在逆境中具有較高的生存能力，加大了防治難度．今后的研究應在病原菌侵染機理和病害防治等方面展開．

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