家蠶病毒病防治研究進展

邵榆嵐，白興榮，黃 平

（云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自661101）

家蠶病毒病是養蠶生產上最普遍、危害最嚴重的一類傳染性疾病，在各個養蠶季節均可發生，特別是夏秋季節，因環境條件、飼養管理、蠶體體質等因素稍有不慎都可發生病毒病。生產中常見的家蠶病毒病多為核型多角體病、質型多角體病、病毒性軟化病、膿核病4類。現將家蠶病毒病防治研究進展介紹如下。

1 早期診斷

不同蠶病都有不同的病癥表現，發病時肉眼觀察可初步判別其所屬蠶病種類，若此時才采取措施阻止蔓延，往往為時已晚，難以控制。因此，早期鑒別診斷是防止家蠶病毒病擴散的有效措施。

1.1 血清學檢測技術

在家蠶病毒病的血清學診斷中，用已知抗體檢查蠶體內是否存在相應抗原，從而判斷蠶是否被某種病毒感染，其優越性就是可以在病毒感染早期作出判別。

限于中國農村經濟條件與科學文化水平不高等原因，多數家蠶病毒病診斷方法僅停留在實驗室，未能應用于農村生產。目前，根據農村養蠶生產實際條件，時連根等人已制作出簡易實用的“家蠶病毒病血清學診斷盒”，選擇雙向免疫瓊脂擴散法并結合混合抗血清，建立了在農村檢測診斷家蠶病毒病的方法與技術。它能特異、靈敏、快速地檢測診斷出蠶體、蠶室、蠶具中的核型多角體病毒（NPV）、皮質多角體病毒 （CPV）和膿核病毒 （DNV），檢出率高達76.5%。不僅能有效預防農村養蠶生產上病毒病的發生流行，而且對大規模開展農村蠶病調查、流行病學研究等都具有重大的實際意義[1]。

1.2 PCR檢測技術

PCR又稱聚合酶鏈反應，可在體外使基因組的某個部分短時間內擴增幾百萬倍，已廣泛應用于遺傳病診斷、病原體核酸序列、法醫學、遺傳學鑒定以及癌基因突變研究，并應用于DNA分析和分子克隆[2]，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。近年來，PCR檢測技術開始應用于家蠶病毒病檢測，涂納新等人應用PCR技術檢測家蠶核型多角體病毒，從患病家蠶血淋巴中抽提總DNA，根據病毒基因組序列設計一對特異性引物在體外擴增，如果產物在瓊脂糖凝膠電泳中有特異性條帶，則判定為感病。此外，通過感染病毒病的家蠶不同組織中檢測出陽性反應時間的不同證明傳染途徑的不同和發病快慢的不同[3]。PCR檢測技術因其成本高，操作不便，在蠶病早期診斷的應用不多，一般只應用于實驗室或質檢機構。

2 防治方法

2.1 高溫治療

日本學者井上元于1976年對感染病毒病的家蠶進行高溫處理，研究其對病毒病的抑制作用。井上之分別用病毒性軟化病病毒（FV）和CPV病毒的致死劑量[FV（0.1/ml）和CPV（CP107／ml）]對蟻蠶和4齡起蠶添食接種，27℃飼養并在2～5齡各蛻皮期分別用37℃高溫處理，采用各種免疫化學方法研究高溫療效。結果表明，感染FV的家蠶在27℃下飼養，全部發病斃死；經37℃高溫處理24h結繭率65%～95%。感染CPV的家蠶以27℃飼養，中腸病變明顯，發病斃死。經37℃高溫處理24h、48h，有50%蠶結繭；37℃高溫處理72h，結繭率高達90%[4]。此外，余國東的研究也表明，高溫處理的適期是眠中至蛻皮12h，效果最為顯著，可能是因為高溫可阻礙細胞質多角體的形成，同時被病毒感染的中腸細胞在幼蟲蛻皮期向組織外脫落，從而填補了新生細胞[5]。

2.2 藥物添食

2.2.1 抗病毒藥劑

從家蠶病毒病的治療來看，用于臨床治療的藥劑并不多，原因可能是抑制病毒增殖的藥物對宿主也有毒性，難以實用化。盡管如此，家蠶病毒病的藥劑治療研究還是取得了一定的進展。據報道5-氟尿嘧啶等尿嘧啶代謝類似物可作為抗病毒藥劑，有效濃度為5×10-4～5×10-5mol/L的5-氟尿嘧啶可使病毒性軟化病的發病率降低20%～30%；9-氨基乳酸吖啶能使核型多角體病的發病率降低30%～60%；烷基化5’-鳥嘌呤核苷酸能使蠶對NPV的抗性提高1000倍以上；萘啶酸銅對家蠶核型多角體病和病毒性軟化病的發病率有明顯抑制作用，但對質型多角體病無效；胍對病毒性軟化病有一定的治療作用；果糖嗪對核型多角體病、質型多角體病、病毒性軟化病的發生有一定的抑制作用。一些對家蠶病毒病治療有效的藥物[6～9]已經投放市場，但在生產實際中卻未得到普通認可。

2.2.2 抗菌藥物

國內外研究證實，家蠶病毒病的發生與腸道細菌有密切關系。細菌病的發生會導致蠶體虛弱，降低對病毒病的抵抗能力。CPV與腸桿菌能同時感染圓筒狀細胞引起發病。FV與細菌混合接種，發病率比單獨接種明顯增加，單獨接種FV發病率很低或不發病，而細菌的存在會明顯提高病毒性軟化病的發病率。目前有效的應對措施就是使用抗菌素。蠶期中添食諾氟沙星（氟哌酸）對抑制蠶體內細菌的繁殖、降低死亡率和病毒感染率、保持蠶兒發育整齊和推遲發育時間等都有顯著效果[10]。以鹽酸環丙沙星為主要成分的蠶用鹽酸環丙沙星膠囊的預防用量（100mg/kg）和治療用量（150mg/kg），效果優于氯霉素、紅霉素，且使用方便，安全可靠，可作為防治家蠶細菌病的理想藥物[11]。朱方容等人在多種抗菌藥物比較試驗中發現，蠶服康1號的治療效果最優，其次為新藥B[12]。余柳濤等人的試驗結果表明，中國農科院蠶業研究所生產的亞迪蠶豐對預防家蠶細菌病的效果比鹽酸諾氟沙星好，與鹽酸環丙沙星相當[13]。實際上，抗菌素對家蠶病毒病無直接作用，使用不當反而對蠶造成潛在威脅，應避免濫用。

2.3 弱毒苗

弱毒苗是家禽疾病免疫防治用的1種生物制劑。它與強毒苗的根本區別在于前者無傳染性，后者有傳染性，且使用弱毒苗的原發動物繼代數代后不會使弱毒變強，具有產生免疫早、免疫持續期長的特點。同一細胞被2種病毒入侵時，往往產生2種完全不同的結果：一種情況是2種病毒互不相干各自增值，另外一種情況是一種病毒抑制另一種病毒的增殖。第2種現象被稱為干擾現象。關于干擾現象的機制，推斷是家蠶食下不活化的病毒后，其消化液中或中腸皮膜細胞靠圍食膜一面形成抗病毒狀的物質，由此抑制病毒的感染，因而病毒病發病率受到抑制[14]。質型多角體病毒不同株系之間存在明顯的干擾現象。利用熱處理、紫外線照射、甲醛滅活的CPV毒力減弱，給蠶添食后，對活性CPV的感染有干擾作用。用丙內酯或熱滅活的NPV給家蠶添食也可獲得一定的免疫。弱毒苗要求被接種對象是健康無病的，疫苗應現配現用，使用過程中不斷搖動，并且使用疫苗時最好停止使用消毒藥物。

2.4 抗病育種

在家蠶各種防病措施中，以提高家蠶本身的抗病能力為目的的抗病育種是最佳的解決途徑，能從根本上阻止或減少蠶病的發生。

家蠶的抗病性受基因控制，且受隱性基因控制的感染抵抗性容易導入實用品種中，如蠶對DNV的感染抵抗性多數情況下受隱性基因控制；從生產應用的角度看，受顯性基因控制的感染抵抗性應用價值最大，一旦導入實用品種，較穩定且F1代抗病性就得以體現，如某些品種對NPV、CPV的感染抵抗性受顯性基因控制。段家龍認為，家蠶對CPV的感染抵抗性受多基因控制，加性效應占主要作用，F1代有雜交優勢，有偏父遺傳現象[15]。張志芳采用閥性狀擬連續性方法研究發現，家蠶對CPV感染抵抗性的基因位點不少于2個，而且是顯性效應大于加性效應，并存在超顯性現象[16]。錢荷英等試驗表明，家蠶對NPV的感染抵抗性存在雜種優勢現象，即F1代的抵抗性明顯高出兩親本的平均值，而且還高出抗體親本，呈超顯性現象[17]。經典的抗病育種常常采用回交的方法將抗病基因導入實用品種，對于抗病顯性基因的導入可以在回交代中添毒篩選。但對于抗病隱性基因常常在回交后自交一代，再通過添毒篩選保留隱形抗病基因[15]。荒武以秋光×龍白的雜種后代為材料，用高濃度的游離NPV病毒注射蛹體，連續經過8代，選育系對NPV蛹體皮下注射感染抵抗性比未選系提高10～100倍[16]。陳克平對中國部分家蠶實用品種和保存種進行抗DNV調查，篩選出8個抗性品種，通過回交的方法將抗病基因導入家蠶實用品種，組配的一代雜交種對DNV全抗，并已達到家蠶實用品種的水平[17]。

傳統的抗病育種不僅周期長，添毒篩選準確性差，且容易污染環境。隨著分子生物技術的迅猛發展，分子標記技術的出現給家蠶抗病育種工作帶來了新的發展契機。目前在家蠶育種分子標記中一般運用RFLP標記（限制性片段長度多態性）、RAPD標記（隨機擴增多態性DNA）、AFLP標記（擴增片段長度多態性）。家蠶分子標記輔助育種是分子標記在家蠶育種上的一個重要應用。利用上述分子標記在雜交和回交中追蹤特定基因流向，用最短的育種時間和最小的育種規模，達到育種期望。利用分子標記輔助育種的步驟：（1）選擇供體親本和輪回親本；（2）篩選出期望導入目的基因的分子標記；（3）分析BC1代各個體標記進行保留或淘汰，同樣的方法到BC5或BC6代；（4）若選擇的目的基因是隱性基因，則采用RAPD即可獲得，若選擇的目的基因是顯性基因，則進行自交，自交后可采用RFLP標記區分3種基因或用RAPD標記選擇后代推測上代基因[18]。賀一原、何斯美等用RAPD技術對家蠶抗膿核病近等基因系進行分子標記，獲得OPF-062000和OPF-0619002個標記[17]。姚琴、李木旺等進行家蠶抗NPV分子標記研究，獲得了與家蠶抗NPV有關的分子標記OPA-18700，并在回交世代中檢測驗證了其可靠性[20]。

2.5 消毒預防

病毒粒子的存在是家蠶病毒病發生的先決條件。能有效打開病毒多角體，使病毒粒子充分暴露的快捷途徑是使用消毒劑。目前常用的殺病毒消毒劑按其主要成分大致分為氯制劑、醛類、表面活性劑和石灰[21]。含氯消毒劑能迅速氧化、破壞病毒衣殼上的酪氨酸，抑制病毒的特異性吸附，阻止其對宿主細胞的感染，生產上一般使用堿性較強的漂白粉，而對于堿性不強或溶液呈弱酸性的優氯凈可配合石灰等使用，用于蠶室蠶具的消毒；醛類消毒劑主要與蛋白質中的氨基結合使其變性或使蛋白質分子烷基化，主要有甲醛、戊二醛等制劑，多用于環境消毒；表面活性劑類消毒劑以季胺鹽類為主，能迅速滲入胞漿膜脂質和蛋白質體，改變細胞膜通透性，目前主要有蠶季胺Ⅰ號、蠶季胺Ⅱ號和蠶康寧等[22]；石灰是養蠶業最常用又廉價的消毒劑，其強堿性可使病毒多角體外殼迅速溶解，釋放出游離病毒而被殺死，對家蠶NPV、CPV有良好預防和控制效果[21]。一般消毒藥劑若單劑使用時，穩定性較差，腐蝕性、刺激性強，其應用范圍受到限制。近年來，復合配方和新劑型與其他消毒劑的協同作用，提高了消毒效果和穩定性，是當前消毒劑的研究方向。目前，國內有許多有機氯復方劑出現，如二氯異氰尿酸鈉復方制劑、三氯異氰尿酸復方制劑等。“安滅殺”消毒劑為戊二醛和專利季胺鹽的復方劑，2種成分有相加效果，是消毒劑最佳組合之一[22]。

近年來，臭氧用于消毒殺菌已成為消毒劑行業的新型材料和研究熱點，廣泛應用于醫學、防疫、水處理等方面，但在蠶業生產中應用甚少。有研究報道，采用新生臭氧氣流進行局部有針對性的處理家蠶病毒多角體30min后，病毒對家蠶失去感染力，且蠶體生長發育及生理機能無不良反應，進一步研制出1種養蠶專用消毒儀器，臭氧有可能成為蠶桑生產中一種無污染而又高效的綠色消毒劑[23]。

3 展望

家蠶病毒病的防治一直以來都是生產上的重點處理環節，但目前應對措施主要還停留在消毒防病的基礎階段。高溫治療在生產上存在2個問題，一是高溫療法對非包涵體病毒的作用較明顯，而對包涵體病毒的效果較差。二是高溫療法所用的溫度已超過蠶的適溫范圍，可能引起蠶體虛弱，發生細菌性腸胃病。所以在實際應用中，最好只針對已早期診斷確定為病毒病的病蠶進行高溫處理，以降低病害，減少損失，避免影響健康蠶。

100多年來，家蠶作為實驗動物在經典遺傳學、動物遺傳學、發育生物學、細胞生物學、昆蟲免疫學等領域受到廣泛關注。隨著21世紀科學技術的高速發展，家蠶作為現代生命科學研究的模式生物，在基因組學、人類疾病、發生生物學、醫藥學、鱗翅目病蟲害以及環境監測等領域具有更重要的研究價值。

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