YC-1抗肝癌作用機制的研究進展

羅子儼（綜述），蔣敬庭，秦錫虎（審校）

（1.蘇州大學附屬第三醫院肝膽外科，江蘇常州 213003;2.蘇州大學附屬第三醫院腫瘤生物診療中心，江蘇常州 213003;3.常州市中醫院，江蘇常州 213003）

3-（5'-羥甲基-2'-呋喃基）-1-苯甲基吲唑［3-（5'-hydroxymethyl-2'-furyl）-1-benzyl indazole，YC-1］是一種人工合成的化合物，Ko等［1］首次發現其可抑制分離的血小板聚集、三磷酸腺苷釋放，并能提高細胞內游離鈣濃度，這一作用是由鳥苷酸環化酶的激活、環磷酸鳥苷和環磷酸腺苷的升高引起的。隨著對YC-1的深入研究還發現其對防止血管內血栓形成、激活血管平滑肌可溶性鳥苷酸環化酶而舒張動脈等具有重要的意義［2］。Teng等［3］發現，YC-1 在血小板豐富時有抗血栓形成的作用。Yu等［4］發現，YC-1在體外抗小鼠血管平滑肌細胞增殖;也有研究報道其對主動脈平滑肌松弛有調節作用［5］。YC-1 在抗腫瘤方面的作用主要包括抑制低氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）［6］、細胞周期 阻 滯［7］、誘 導 細 胞 凋亡［8］、抗血管生成［9］和抗炎性反應［10］等。針對抗肝癌的作用機制，YC-1主要通過抑制HIF-1和血管內皮細胞因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）的表達來抑制肝癌的轉移與復發。因此，抗肝癌的作用機制已成為近年來肝癌免疫治療的研究熱點。

1 YC-1抑制HIF-1和VEGF的抗腫瘤作用

缺氧是實質性腫瘤物理微環境的基本特征之一。許多實體腫瘤具有缺氧的微環境，腫瘤細胞對缺氧的自身調節和適應機制主要是通過提高葡萄糖轉運、糖酵解及形成血管體系。腫瘤的缺氧不僅是發生惡性轉化的始動因素，還可以誘導腫瘤細胞對放療及化療的耐受性，促進腫瘤的浸潤和轉移等惡性生物學行為的發生［11］。

HIF-1位于染色體14q21～24，作為一轉錄因子作用于低氧誘導基因，表達于多種人類惡性腫瘤中，在腫瘤的發展中扮演著重要角色。HIF-1是目前所發現的介導細胞缺氧反應最關鍵的核轉錄因子，由HIF-1α和HIF-1β兩種亞基聚合而成，活性由HIF-1α決定。它涉及缺氧時的能量代謝、血管生成、細胞存活、侵襲和抗藥性。因此，抑制HIF-1的表達成為人類抗癌治療的新平臺［12］。

VEGF是一種作用強大的促血管生長因子，在肝癌的發生轉移過程中占中心地位，作為與原發性肝癌轉移和預后有關的重要因子，已經得到深入的研究。在正常肝臟組織中，VEGF的表達很低，但在原發性肝癌肝外轉移灶中有明顯升高的表達［13］，有助于肝癌的溶骨性轉移［14］。VEGF與趨化因子受體CXC家族趨化因子受體4、細胞角蛋白CK-19被證實為肝癌淋巴結轉移的獨立危險因素。大量研究已經表明，VEGF不僅可獨立影響和衡量肝癌預后，而且可與多種細胞因子共同作用來促進肝癌的轉移與復發［15］。VEGF已經成為肝癌治療靶向藥物首選作用的細胞因子，如貝伐單抗［16］、黃連素［17］等。HIF-1 位于VEGF啟動子中，任何一種抑制HIF-1的藥物都可影響VEGF的表達。

YC-1的作用不依賴一氧化氮，但其作用類似于一氧化氮的某些生物學反應。在缺氧細胞中YC-1阻斷促紅細胞生成素和VEGF mRNΑ的表達，并且抑制HIF-1的DNA結合，同時也減少因鈷和脫鐵氨誘導的HIF-1聚集。研究發現［18］，YC-1對HIF-1的作用更多的是抑制HIF-1的激活，而并非減少HIF-1的蛋白水平。它抑制反式激活應答區必須依賴反式激活結構域中缺氧相關酶Asn803，該酶為抑制HIF-1的靶點。

有研究表明在小鼠實驗中，YC-1抑制肝癌細胞中HIF-1α的合成和穩定，這一作用機制依賴小鼠雙微體 2［19］。Shin 等［20］將肝癌 Hep3B 細胞以聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡法測定HIF-1α表達，發現HIF-1α在常氧條件（20%氧濃度）下表達很低，并且HIF-1α siRNA和YC-1同樣可以抑制其表達，這說明在常氧條件下，HIF-1α的抑制也可能阻止腫瘤的侵襲和轉移。該研究還提示，肝臟轉移的媒介是靜脈系統，而不是腹膜種植和細胞從脾臟滲漏出來。經YC-1治療后，鼠的肝臟熒光強度下降99.97%，轉移灶也明顯下降。該研究通過生化方式檢測肝臟轉移病灶熒光蛋白水平，發現YC-1治療后的肝臟熒光蛋白明顯下降。這些研究表明，YC-1能在體內有效地抑制肝轉移。Xia等［21］發現在低氧條件下（1%氧濃度），HIF-1α和熱休克蛋白在HepG2細胞中顯著增加，以YC-1或 HIF-1α siRNA作用于 HepG2細胞，HIF-1α和熱休克蛋白受到明顯抑制。另外，針對VEGF啟動子中HIF-1α激活位置的抗基因技術能抑制VEGF的表達和肝癌細胞生長［22］。

惡性腫瘤的侵襲和轉移是癌癥的重要特點，其中新生血管成為中心環節。VEGF和VEGF受體在血管生成中有重要作用。在腫瘤內部存在低氧環境，HIF-1α有很明顯的高表達，同時VEGF水平也增高，新生血管密度增加，促進腫瘤生長。HIF-1α是VEGF主要的上游調控因子，HIF-1α/VEGF信號通路已被證實與促進肝癌形成有關［23］。YC-1抑制HIF-1α，從而負調控VEGF的表達，抑制肝癌血管生成，抑制肝癌的生長、侵襲和轉移。

2 YC-1對細胞周期阻滯的作用

在細胞周期中，YC-1能有效抑制細胞生長。它發揮作用主要在細胞周期的 G0～G1期［7］:在 G1期YC-1誘導一種細胞生長抑制素來阻滯細胞周期變化。用50 μmml/L劑量的YC-1作用于肝細胞癌HA22T細胞株時，YC-1不會引起明顯的細胞死亡和乳酸脫氫酶的釋放。因此，YC-1對細胞的影響不是通過細胞毒性作用而是通過抑制細胞生長實現的。當YC-1的劑量在10～100 μmml/L變化時，細胞周期的抑制也主要出現在G1期，并伴隨S和G2～M期變化。同時，YC-1誘導細胞凋亡是一種非環磷酸鳥苷依賴途徑。蛋白激酶G抑制劑KT-5823等依賴環磷酸鳥苷蛋白激酶不能阻礙YC-1對細胞周期的抑制作用，而單純運用YC-1的細胞內環磷酸鳥苷沒有過多表達。

細胞周期依賴激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI）p21CIP1/WAP1和相關的細胞周期依賴激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）2是 YC-1誘導HA22T細胞G1期阻滯的因素。YC-1對HA22T細胞中細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白E、CDK2或CDK4的表達無明顯改變。相反，YC-1能刺激p21CIP1/WAF1的大量增加和p27KIP1的適量增加。YC-1同時作用于 CKI p27KIP1和 CKI p21CIP1/WAF1，它們是CDK細胞周期蛋白的相關蛋白，用免疫沉淀法觀察YC-1對CDK-CKI化合物的影響，研究發現YC-1明顯提高了 CKI p21CIP1/WAF1和 CDK2的結合而并非CKIp27KIP1，而兩者對 CDK4 的結合均沒有升高［7］。因此，CKI p21CIP1/WAF1的上調和與其相關的CDK2說明YC-1誘導HA22T細胞G1期阻滯。

Yeo等［24］發現YC-1作用于肝細胞癌Hep3B細胞株24 h后，S期細胞明顯增多，比作用前增加33%，而G0～G1期的細胞數量下降32%。此時去除YC-1后，S期細胞減少到與對照組相同的水平。說明YC-1對Hep3B細胞S期的阻滯作用是可逆的，并且與胚胎腎臟細胞HEK293和腎癌細胞Caki-1相比，YC-1的抑制作用雖不及 HEK293敏感，但比Caki-1更敏感。在不同肝癌細胞株中，YC-1對細胞周期的不同階段有抑制作用，說明其抗癌作用具有普遍性和特異性。

YC-1能在一定程度上誘導肝癌細胞凋亡。Lau等［25］研究表明，YC-1能獨立下調磷酸化信號轉導蛋白和轉錄激活物的表達。在體外實驗中，當其與順鉑聯合時，YC-1能進一步促進腫瘤細胞凋亡，降低轉錄激活物和細胞周期蛋白D1的表達，并誘導天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9的分裂。在體內實驗中，YC-1聯合順鉑明顯抑制原發性肝癌移植模型腫瘤的生長，其作用同樣伴隨YC-1對轉錄激活物和細胞周期蛋白D1的下調和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9的分裂。依賴轉錄激活物途徑，增強原發性肝癌對順鉑的敏感性，為YC-1新的抗癌機制。

3 YC-1的抗炎作用

癌癥常伴有長期的慢性炎癥，如胃癌伴有胃炎、食管癌伴有食管炎、肝癌伴有乙型肝炎等。YC-1的抗炎作用同樣具有抗惡性腫瘤作用。Lu等［10］研究表明，YC-1可抑制炎性反應時脂多糖誘導一氧化氮和前列腺素2的產物，應答脂多糖作用的誘導型一氧化氮合酶和環氧化酶2的蛋白水平及mRNA也可受到YC-1的抑制。另外，YC-1可減少炎性因子mRNA的表達，如腫瘤壞死因子和白細胞介素1β。在乙型肝炎病毒感染后形成的肝癌細胞中，VEGF、血管生成素1、血管生成素2和金屬蛋白酶9都有明顯升高的表達，而且血管生成素2和（或）金屬蛋白酶9與原發性肝癌切除后的復發有明顯相關性。

4 展望

研究已經證實YC-1的具有抗腫瘤作用。目前YC-1在腎臟腫瘤、白血病、子宮腫瘤等領域都有報道，在針對肝癌的研究主要是其對HIF-1和VEGF的抑制作用，動物實驗和細胞實驗都成功證實YC-1對HIF-1的抑制作用，并發現HIF-1α為VEGF啟動調控因子，抑制其表達。鑒于這一作用和VEGF在多種腫瘤中都有表達，YC-1有望成為新的抗癌藥物，但仍需進一步研究其藥理和毒理作用，探討對正常細胞的不良反應。對于細胞周期阻滯，YC-1對不同細胞的作用機制不同，對細胞周期的抑制也不同。多途徑對細胞周期阻滯，使YC-1的這一作用具有特異性。YC-1的抗炎作用，目前研究有限，抗炎機制在抗肝癌中的作用還不完全明確，有待于進一步探討。研究YC-1在肝癌發生、發展中的作用，可為肝癌的治療提供新的途徑。

［1］Ko FN，Wu CC，Kuo SC，et al.YC-1，a novel activator of platelet guanylate cyclase［J］.Blood，1994，84（12）:4226-4233.

［2］Wegener JW，Nawrath H.Differential effects of isoliquiritigenin and YC-1 in rat aortic smooth muscle［J］.Eur J Pharmacol，1997，323（1）:89-91.

［3］Teng CM，Wu CC，Ko FN，et al.YC-1，a nitric oxide-independent activator of soluble guanylate cyclase，inhibits platelet-rich thrombosis in mie［J］.Eur J Pharmacol，1997，320（2/3）:161-166.

［4］Yu SM，Cheng ZJ，Guh JH，et al.Mechanism of anti-proliferation caused by YC-1，an indazole derivative，in cultured rat A10 vascular smooth-muscle cells［J］.Biochem J，1995，306（Pt 3）:787-792.

［5］Wegener JW，Gath I，Forstermann U，et al.Activation of soluble guanylyl cyclase by YC-1 in aortic smooth muscle but not in ventricular myocardium from rat［J］.Br J Pharmacol，1997，122（7）:1523-1529.

［6］Yeo EJ，Chun YS，Cho YS，et al.YC-1:a potential anticancer drug targeting hypoxia-inducible factor 1［J］.J Natl Cancer Inst，2003，95（7）:516-525.

［7］Wang SW，Pan SL，Guh JH，et al.YC-1［3-（5'-Hydroxymethyl-2'-furyl）-1-benzyl Indazole］exhibits a novel antiproliferative effect and arrests the cell cycle in G0～G1in human hepatocellular carcinoma cells［J］.J Pharmacol Exp Ther，2005，312（3）:917-925.

［8］Huang YT，Pan SL，Guh JH，et al.YC-1 suppresses constitutive nuclear factor-kappaB activation and induces apoptosis in human prostate cancer cells［J］.Mol Cancer Ther，2005，4（10）:1628-1635.

［9］Du J，Zhao Q，Gu H，et al.Inhibitory effect of YC-1 on induction of VEGF and GPI genes in hypoxic human pancreatic cancer cells［J］.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2006，28（7）:486-489.

［10］Lu DY，Tang CH，Liou HC，et al.YC-1 attenuates LPS-induced proinflammatory responses and activation of nuclear factor-kappaB in microglia［J］.Br J Pharmacol，2007，151（3）:396-405.

［11］Marx J.Cell biology.How cells endure low oxygen［J］.Science，2004，303（5663）:1454-1456.

［12］Yeo EJ，Chun YS，Park JW.New anticancer strategies targeting HIF-1［J］.Biochem Pharmacol，2004，68（6）:1061-1069.

［13］Hirohashi K，Yamamoto T，Uenishi T，et al.CD44and VEGF expression in extrahepatic metastasis of human hepatocellular carcinoma［J］.Hepatogastroenterology，2004，51（58）:1121-1123.

［14］Iguchi H，Yokota M，Fukutomi M，et al.A possible role of VEGF in osteolytic bone metastasis of hepatocellular carcinoma［J］.J Exp Clin Cancer Res，2002，21（3）:309-313.

［15］Xiang ZL，Zeng ZC，Tang ZY，et al.Nuclear accumulation of CXCR4 and overexpressions of VEGF-C and CK19 are associated with a higher risk of lymph node metastasis in hepatocellular carcinoma［J］.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2010，32（5）:344-349.

［16］Finn RS，Zhu AX.Targeting angiogenesis in hepatocellular carcinoma:focus on VEGF and bevacizumab［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2009，9（4）:503-509.

［17］Jie S，Li H，Tian Y，et al.Berberine inhibits angiogenic potential of Hep G2 cell line through VEGF down-regulation in vitro［J］.J Gastroenterol Hepatol，2011，26（1）:179-185.

［18］Li SH，Shin DH，Chun YS，et al.A novel mode of action of YC-1 in HIF inhibition:stimulation of FIH-dependent p300 dissociation from HIF-1{alpha}［J］.Mol Cancer Ther，2008，7（12）:3729-3738.

［19］Lau CK，Yang ZF，Lam CT，et al.Suppression of hypoxia inducible factor-1alpha（HIF-1alpha）by YC-1 is dependent on murine double minute 2（Mdm2）［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，348（4）:1443-1448.

［20］Shin DH，Kim JH，Jung YJ，et al.Preclinical evaluation of YC-1，a HIF inhibitor，for the prevention of tumor spreading［J］.Cancer Lett，2007，255（1）:107-116.

［21］Xia LM，Tian DA，Zhang Q，et al.Hypoxia induces heat shock protein HSP70-2 expression in a HIF-1 dependent manner［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2009，17（3）:207-212.

［22］Ding L，Chen X，Jing K，et al.Inhibition of the VEGF expression and cell growth in hepatocellular carcinoma by blocking HIF-1alpha and Smad3 binding site in VEGF promoter［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2006，26（1）:75-78.

［23］Wang W，Jia WD，Xu GL，et al.Antitumoral activity of rapamycin mediated through inhibition of HIF-1alpha and VEGF in hepatocellular carcinoma［J］.Dig Dis Sci，2009，54（10）:2128-2136.

［24］Yeo EJ，Ryu JH，Chun YS，et al.YC-1 induces S cell cycle arrest and apoptosis by activating checkpoint kinases［J］.Cancer Res，2006，66（12）:6345-6352.

［25］Lau CK，Yang ZF，Lam SP，et al.Inhibition of Stat3 activity by YC-1 enhances chemo-sensitivity in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Biol Ther，2007，6（12）:1900-1907.